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培养细胞中RNA提取及检测

相关实验:RNA提取及检测

最新修订时间:

简介

RNA的提取通过变性剂破碎细胞或者组织,然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA,再经过沉淀,洗涤,晾干,最后溶解。但是由于RNA酶无处不在,随时可能将RNA降解,所以实验中有很多地方需要注意,稍有疏忽就会前功尽弃。

原理

RNA提取的基本原理是利用异硫氰酸(guanidineisothiocyanale)是一类有效解偶剂,当细胞被它溶解后,蛋白质二级结构消失,细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸解离。在4 mol/L异硫氰酸胍和β-巯基乙醇存在下,RNA酶失活,可提取完整的总RNA。

材料与仪器

器材:

①15 ml、10 ml、5 ml离心管,5 ml移液管,1 ml可调加样器

②匀浆器,低温高速离心机,普通离心机

③紫外分光光度计

试剂:

①材料培养细胞RNA来源

②预冷的PBS缓冲液

③变性液

④氯仿-异戊醇

⑤2 mol/L乙酸钠(pH4.0)

⑥预冷无水乙醇,预冷75% 乙醇,DEPC处理水

⑦0.25% 胰蛋白酶

步骤

提取培养细胞中RNA的基本过程可分为如下几步:

(一)试剂的配制

(1)变性液的配制 异硫氰酸胍,47.3 g;十二烷基肌氨酸钠,0.5 g;2.5 ml 1mol/L柠檬酸钠(pH7.0);0.7 ml β-巯基乙醇;DEPC处理的双蒸水,定容至100 ml,65 ℃加热并搅拌助溶。
(2)焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)处理水 加0.2 ml焦碳酸二乙酯到待处理的100 ml水中,猛烈振播使DEPC均匀混入水中,37 ℃过夜,高压灭菌(1.034 x 105 Pa, 30 min)。
(3)乙酸钠溶液(2 mol/L,pH4.0)乙酸钠,54.4 g;DEPC处理水,20 ml;用冰醋酸调pH至4.0,加DEPC处理水至200 ml,高压灭菌(1.034 x 105 Pa,20 min)。
(4)氯仿-异戊醇混合液(49:1)氯仿,49 ml;异戊醇,1 ml;混合上述液体,4 ℃保存。
(5)70% 乙醇的配制 无水乙醇,70 ml;DEPC处理水定容至100 ml;混合后置-20 ℃保存。

(二)RNA提取

(1)收集107个以上的细胞 贴壁培养细胞用0.25% 胰蛋白酶消化,PBS重悬细胞并转移至10 ml离心管中;悬浮培养细胞可直接转移至离心管。
(2)离心(2000 g x 5 min)。PBS洗涤细胞2次。
(3)加2 ml预冷的变性液,充分摇动,使细胞裂解完全。
(4)加0.2 ml 2 mol/L乙酸钠(pH4.0),翻转混合,转移至5 ml离心管中。
(5)加0.5 ml氯仿[氯仿-异戊醇(49:1)],翻转混合,猛烈振摇10 s,冰浴15 min。
(6)4 ℃离心(10000 g x 20 min)。
(7)将上层水相移入新15 ml离心管,加2倍体积冷无水乙醇,置-20 ℃保持1 h以上。
(8)4 ℃离心(10000 g x 20 min)。
(9)弃上清液,加2 ml变性液重悬沉淀。
(10)转入新管,加2倍体积冷乙醇置-20 ℃沉淀1 h以上。
(11)4 ℃离心(10000 g x 20 min)。
(12)沉淀用70% 乙醇洗1次。
(13)空气干燥,沉淀溶解在100 μl DEPC处理水中,-70 ℃贮存。

(三)实验结果及分析

(1)取4 μlRNA样品,100倍稀释后于分光光度计上测定260 nm、280 nm处的吸光度值。
(2)样品RNA浓度(μg/ml)=A260 x 40(μg/ml)x稀释倍数。A260/A280应在1.9~2.0之间,如小于该值,则可能有蛋白杂质。

注意事项

(1)在提取总RNA时一个非常值得注意的问题是防止RNA酶的混入,一般实验室的玻璃器皿、唾液和汗液都可能是RNA酶的污染源,故在操作时始终应戴一次性手套进行,玻璃器皿应在250 ℃烘烤4 h以上或180 ℃烘烤9 h以上,其他器具如电泳仪,应用3% H2O2浸泡2 h以上,用0.2% DEPC处理的高压灭菌的蒸馏水冲洗3次以上,烘干待用。

(2)获得抽提mRNA的成功关键是在一开始即将内源性的RNA酶活性减低到最小和在操作过程中防止器皿、唾液和汗等污染。本法在一开始破碎细胞的同时使核酸酶失活,从而可得到较高的回收率。

(3)总RNA在液相,DNA及蛋白质在液相与异硫氰酸胍相之间。

(4)停止离心机以不用刹车为好。

来源:丁香实验

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