培养细胞中RNA检测－Northern Blot

培养细胞中 RNA 检测－ Northern Blot

 

1． 制胶：（ 1 ％）

琼脂糖                 2.5g

 

10 × Mops 缓冲液    25.0ml

 

H₂ O               192.0ml

2． 在微波炉中加热煮沸使胶完全溶于水并灭菌。

3． 取出胶冷却到 60 ℃，于通风柜中加 45ml 甲醛，混匀。

4． 加 20 μ l 溴化乙锭，混匀。

5． 令胶液再冷却 10 分钟。

6． 将其倒入四面封好的电泳槽中，加样品梳，约 20 分钟形成电泳凝胶。

7． 加入 1 × Mops 缓冲液于电泳槽，盖满胶表面，但不 >1cm 。

8． 取 10 ～ 15 μ g RNA 样品，真空离心干燥，再溶于 20 μ l 载样缓冲液，加热 95 ℃ 2 分钟，使 RNA 变性。

9． 每孔中 20 μ l RNA 点样，同时加一标准物。

10．  一般 35V 电泳，从下午 4pm ～ 9 ： 30am 。

11．  取出胶在紫外灯下观察，将刻度尺放在胶旁照像。成功的电泳在胶上 28S （约 5kb ） 18s （约 2kb ）处可见明显的溴化乙锭带。

12．  用 500ml 10 × SSC 浸泡洗涤胶 2 次，每次 20 分钟，去除甲醛。

13．  其它吸印步骤完全与 Southern Blot 相同，只是吸印缓冲液为 10 × SSC 。

14．  室温下至少吸印 12 小时。

15．  吸印完成后，取出胶与滤膜，表明加样起始部位、膜的方向及标号、用 Whatman 滤纸包好， 80 ℃真空干燥 2 小时；如为尼龙膜在紫外灯下照射 5 分钟。

16．  分子杂交：杂交原理与 Southern Blot 相同，但所用杂交液及杂交、洗涤温度与之不同。预杂交液制备：

50 ％ 甲酰胺

 

1 ％ SDS

 

1M NaCl

 

10 ％ 硫酸葡聚糖

17．  将滤膜放入塑料袋，加入 10ml 预杂交液，去除气泡后封袋，在 42 ℃水浴中振荡至少 6 小时。

18．  制备变性鱼精 DNA ≥ 100 μ g/ml ，变性同位素标记的探针（加入袋中的终浓度≤ 10ng/ml 或 1 ～ 4 × 10⁵ dpm/ml ）。

19．  将此液 0.5 ～ 1ml 以针头注入含预杂交液的塑料袋中，排除气泡，从针眼处重新封死塑料袋，再用玻棒在袋上赶几次，使探针与预杂交液充分混匀， 42 ℃振荡水浴 6 ～ 42 小时。

20．  膜的洗涤：

a.       2 × SSC 100ml 室温中振荡 5 分钟，共 2 次。

b.      1 ％ SDS 的 2 × SSC 200ml 60 ℃振荡 30 分钟，共 2 次。

c.       0.1 × SSC 100ml 室温振荡 30 分钟，共 2 次。

 

21. 膜在室温中自然干燥后，用塑料纸包好即可进行放射自显影过程（同 DNA 检测）。