RNA 提取与检测

1. 组织来源材料：100 ng 组织加1 ul 变性液，在玻璃Teflon匀浆器中将其匀浆。 2. 培养细胞：离心弃悬浮细胞培养液或倒去单层培养细胞培养液（不需用生理盐水洗涤），每107细胞加入1 ml 变性液，然后用吸管抽吸7~10次。 3. 将匀浆移入5 ml 聚丙烯管子，加入0.1体积的2 mol/l pH4.0的乙酸钠缓冲液，混匀。 4. 加入1 ml 水饱和酚，混匀；再加入0.

在液氮中研磨植物材料, 使部分细胞破碎, 进一步使植物细胞在裂解液中裂解, 用醋酸钠和氯仿沉淀蛋白质, 异丙醇沉淀核酸, 溶解后经氯化锂沉淀总RNA, 洗涤后得到高质量的RNA。本实验旨在了解和掌握植物总RNA 的分离和纯化方法。

一、材料 1. 缓冲液、溶液和试剂 氯仿 氯化铯溶液，5.7mol/L(5.7mol/L 氯化铯，25 mmol/L 醋酸钠，pH6.0，1mmol/LEDTA,pH8.0) 用焦碳酸二乙酯（DEPC) 处理过的水 二硫苏糖醇（DTT)，0.2 mmol/L EDTA,1mmol/L，pH8.0 乙醇，70%(体积分数） 异硫氰酸胍裂解缓冲液 (4mol/L 异硫氰酸胍，25 mm

一、材料 1. 缓冲液、溶液和试剂 去离子化的甲酰胺 焦碳酸二乙酯（DEPC) 处理过的水 消化缓冲液（lmol/L 异硫氰酸胍,25 mmol/Lβ-巯基乙醇，0.5%N-月桂酰肌氨酸，20 mmol/LTris-HCl，pH7.5) 乙醇,100% 和 70% 肝糖 异丙醇 苯酚 (pH4.3): 氯仿（70%:30%) 蛋白酶 K(60 mg/ml，20U/mg) Tri

1. 对于单层培奍细胞 （1）每10 cm 培养皿培养的细胞，用冰冷PBS洗涤3次。 （2）每次1 ml 然后用小体积PBS刮下细胞，转移至冰浴的离心管中。 （3）300 g 离心5 min，弃上清，继续冰浴。 2. 对于悬浮培养细胞 （1）300 g 离心5 min，弃上请。 （2）细胞以1/2原体积的冰冷重悬，再离心后弃上清。 3.

Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液，其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性，随后加入氯仿，酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中，RNA则分布在上层的水相中，最后用异丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗涤沉淀，这样就可以得到比较纯净的总RNA。

一、材料 1. 缓冲液、溶液和试剂 Trizol(Invitrogen) 氯仿 异丙醇 乙醇，70%，用焦碳酸二乙酯（DEPC) 处理过的水配制 DEPC 处理过的水、 液态 N2 NaCl,1.2mol/L 柠檬酸钠,0.8mol/L 2. 特殊设备 转子-定子均化器（或相当的） 研钵和杵，在 DEPC 处理过的水中洗涤，液氮中预冻 50 ml 圆锥形管，例如 Falc

一、材料 1. 缓冲液、试剂和溶液 75% 乙醇 (超纯水配制） 糖原，5 mg/ml(Ambion，Austin，TX) StratageneRNA 提取试剂盒（200345，StratageneCloningSystems，LaJolla,CA)， 包括变性溶液、饱和酚 (存于 4°C)、β-巯基乙醇 (存于 4°C)、氯仿：异戊醇、 2mol/L 乙酸钠、异丙醇。或者使用 Pic

一 材料与设备 1) 磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 2) 硫氰酸胍溶液：4mol/L 硫氰酸胍，0.lmmol/LTris-HClpH7.5，1%β-巯基乙醇 3)CsCl5.7mol/：L(DEPC 处理） 4)TES 缓冲液:0.1%SDS，10 mmol/LTris-ClpH7.4，lmmol/LEDTA 5)3 mmol/L 乙酸钠缓冲液 (PH5.2，DEPC 处理） 6) 无

红细胞裂解液选择性裂解红细胞,然后独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解白细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂，采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和 β-巯基乙醇等变性物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏 RNase 蛋白质中的二硫键。细胞裂解后，细胞释放出蛋白质、DNA、RNA 等物质，再根据它们在不同的 PH 值和

一、材料 1. 缓冲液、溶液和试剂 氯仿 焦碳酸二乙酯（DEPC) 处理过的 H20(GenHimterR105) 乙醇 70% 乙醇洗液（用 DEPC 处理过的 H20 配制） 异丙醇 苯酚-胍盐单相溶液（推荐 RNApure,GenHunterP501-P503) 磷酸盐缓冲液（PBS) 2. 离心机和转头 小离心机 3. 专用设备 50 ml 锥形管 1.5 ml

一、试剂配制 1. PY 试剂的配制：PY 1.0 g 以 100 ml 蒸馏水溶解，配成母液，置 4℃ 冰箱保存。PY 工作液：取 1 ml PY 母液，加入 1 mol/L pH 4.7 的醋酸缓冲液 100 ml，稀释为 0.01% 的浓度。 2. 1.0 mol/L pH 4.7 醋酸缓冲液的配制：冰醋酸 11.55 ml 加蒸馏水至 1000 ml；无水醋酸钠 16.4 g 加蒸馏水

一 材料与设备 1)5%TritonX-100 2) 匀浆缓冲液：50 mmol/LNaCl,50 mmol/LTris-Cl,(PH7.5),5 mmol/LEDTA(pH8.0),0.5%SDS,200ug/ml 蛋甶酶 K 3) 酚：氯仿 (1:1) 4)3mol/L 乙酸钠 (pH5.2)。 5) 乙醇 6)8mol/L 氯化锂 二 操作方法 1) 将待处理的组织放置下一

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获得高质量和完整的 RNA 是很多分子生物学实验中最重要的一步，当前应用最多的是 Trizol/氯仿萃取的方法。

Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇等变性物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。细胞裂解后，细胞释放出蛋白质、DNA、RNA等物质，再根据它们在不同的PH值和不同极性溶剂的溶解

RNA的提取通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

RNA的提取通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。