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基本方案

相关实验:细胞质 RNA 提取实验

最新修订时间:

材料与仪器

RNA
PBS 细胞裂解液 SDS 蛋白酶K 酚 氯仿 异戊醇 无水乙醇
离心机 培养箱

步骤

1.  对于单层培奍细胞

(1)每10 cm 培养皿培养的细胞,用冰冷PBS洗涤3次。

(2)每次1 ml 然后用小体积PBS刮下细胞,转移至冰浴的离心管中。

(3)300 g 离心5 min,弃上清,继续冰浴。

2.  对于悬浮培养细胞

(1)300 g 离心5 min,弃上请。

(2)细胞以1/2原体积的冰冷重悬,再离心后弃上清。
 
3.  重悬细胞于375 μl  冰冷的细胞裂解缓冲液,并置冰浴5 min。

4.  于4℃在微量离心机中离心2 min,将上清移至一个洁净的已加有5 μl 20%SDS的管中,立即在旋涡混合器上振荡。
 
5.  加入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白酶K,37℃温育15 min。
 
6.  加入400 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提,在旋涡混合器上振荡用微量离心机离心,上清移至干净的离心管中,重复抽提1遍。

7.  再以400 μl 氯仿/异戊醇抽棰,上层水相转移至干净的离心管中。

8.  加入40 μl 3 mol/l 乙酸钠缓冲液(pH7.5),再加无水乙醇,混匀后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃过夜。
 
9.  用微量离心机4℃离心15 min 加人1 ml 75%乙醇/25% 0.1 mol/l乙酸钠(pH5.2)冼涤沉淀。

10.  干燥后用100 μl 处理过的水重溶沉淀,取10 μl RNA稀释于1 ml 水中,测A280和A260,其与的RNA可在-70℃贮存。

来源:丁香实验

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