材料与仪器
RNA
PBS 细胞裂解液 SDS 蛋白酶K 酚 氯仿 异戊醇 无水乙醇
离心机 培养箱
PBS 细胞裂解液 SDS 蛋白酶K 酚 氯仿 异戊醇 无水乙醇
离心机 培养箱
步骤
1. 对于单层培奍细胞
(1)每10 cm 培养皿培养的细胞,用冰冷PBS洗涤3次。
(2)每次1 ml 然后用小体积PBS刮下细胞,转移至冰浴的离心管中。
(3)300 g 离心5 min,弃上清,继续冰浴。
2. 对于悬浮培养细胞
(1)300 g 离心5 min,弃上请。
(2)细胞以1/2原体积的冰冷重悬,再离心后弃上清。
(1)每10 cm 培养皿培养的细胞,用冰冷PBS洗涤3次。
(2)每次1 ml 然后用小体积PBS刮下细胞,转移至冰浴的离心管中。
(3)300 g 离心5 min,弃上清,继续冰浴。
2. 对于悬浮培养细胞
(1)300 g 离心5 min,弃上请。
(2)细胞以1/2原体积的冰冷重悬,再离心后弃上清。
3. 重悬细胞于375 μl 冰冷的细胞裂解缓冲液,并置冰浴5 min。
4. 于4℃在微量离心机中离心2 min,将上清移至一个洁净的已加有5 μl 20%SDS的管中,立即在旋涡混合器上振荡。
4. 于4℃在微量离心机中离心2 min,将上清移至一个洁净的已加有5 μl 20%SDS的管中,立即在旋涡混合器上振荡。
5. 加入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白酶K,37℃温育15 min。
6. 加入400 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提,在旋涡混合器上振荡用微量离心机离心,上清移至干净的离心管中,重复抽提1遍。
7. 再以400 μl 氯仿/异戊醇抽棰,上层水相转移至干净的离心管中。
8. 加入40 μl 3 mol/l 乙酸钠缓冲液(pH7.5),再加无水乙醇,混匀后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃过夜。
7. 再以400 μl 氯仿/异戊醇抽棰,上层水相转移至干净的离心管中。
8. 加入40 μl 3 mol/l 乙酸钠缓冲液(pH7.5),再加无水乙醇,混匀后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃过夜。
9. 用微量离心机4℃离心15 min 加人1 ml 75%乙醇/25% 0.1 mol/l乙酸钠(pH5.2)冼涤沉淀。
10. 干燥后用100 μl 处理过的水重溶沉淀,取10 μl RNA稀释于1 ml 水中,测A280和A260,其与的RNA可在-70℃贮存。
10. 干燥后用100 μl 处理过的水重溶沉淀,取10 μl RNA稀释于1 ml 水中,测A280和A260,其与的RNA可在-70℃贮存。
来源:丁香实验