材料与仪器
Triton X-100 匀浆缓冲液 酚 氯仿 乙酸钠 乙醇 氯化锂
步骤
一 材料与设备
1)5%TritonX-100
2) 匀浆缓冲液：50 mmol/LNaCl,50 mmol/LTris-Cl,(PH7.5),5 mmol/LEDTA(pH8.0),0.5%SDS,200ug/ml 蛋甶酶 K
3) 酚：氯仿 (1:1)
4)3mol/L 乙酸钠 (pH5.2)。
5) 乙醇
6)8mol/L 氯化锂
二 操作方法
1) 将待处理的组织放置下一个干烤过的玻璃匀浆器内，弃去无关的液体，用 0.5% TriwnX-100 洗涤蝇胚，以去除培养基。
2) 加 10 倍体积的匀浆缓冲液、立即研磨使组织彻底匀浆化。
3) 于 37℃ 将组织匀浆温育 l h, 间或混匀之。
4）将匀浆移至离心管内，加等体积酚：氯仿（1:1)，剧烈振荡 1 min，用吊桶式转头于室温以 5000 g 离心 l0mim, 使水相和有机相分开。
5) 将上层水相移至另一离心管内. 按步骤 4 用酚：氯仿（1:1) 再抽提 1 次。
6) 将水相移至为-管内，加 0.1 体积 3mol/L 乙酸钠 (PH5.2)，混匀，加 2.5 倍体积冰预冷的乙醇，冰浴 2 h
7) 于 4°C 以 5000 g 离心 l5 min，小心去除上淸液，室温晾下 RNA 沉淀. 少量水溶解RNA, 加 3 倍体积乙酔，于—70℃ 储存备用.如要除去糖蛋白和卵黄物质，则可根据需要逬行步骤 8)〜11)
8) 用少量水重溶 RNA 沉淀，加等体积经髙压灭菌的 8mol/L 氯化锂，混匀，一 20℃放置 3 h 以上。
9) 于 4℃ 以 10000 g 离心 30 min 沉淀 RNA, 小心弃上清。
10) 用 70% 乙醇洗涤沉淀，离心片刻，弃去上清液. 于空气中晾干核酸沉淀。
11) 用少量水重溶 RNA, 加 3 倍体积乙醇，于 一 70℃ 储存备用。
1)5%TritonX-100
2) 匀浆缓冲液：50 mmol/LNaCl,50 mmol/LTris-Cl,(PH7.5),5 mmol/LEDTA(pH8.0),0.5%SDS,200ug/ml 蛋甶酶 K
3) 酚：氯仿 (1:1)
4)3mol/L 乙酸钠 (pH5.2)。
5) 乙醇
6)8mol/L 氯化锂
二 操作方法
1) 将待处理的组织放置下一个干烤过的玻璃匀浆器内，弃去无关的液体，用 0.5% TriwnX-100 洗涤蝇胚，以去除培养基。
2) 加 10 倍体积的匀浆缓冲液、立即研磨使组织彻底匀浆化。
3) 于 37℃ 将组织匀浆温育 l h, 间或混匀之。
4）将匀浆移至离心管内，加等体积酚：氯仿（1:1)，剧烈振荡 1 min，用吊桶式转头于室温以 5000 g 离心 l0mim, 使水相和有机相分开。
5) 将上层水相移至另一离心管内. 按步骤 4 用酚：氯仿（1:1) 再抽提 1 次。
6) 将水相移至为-管内，加 0.1 体积 3mol/L 乙酸钠 (PH5.2)，混匀，加 2.5 倍体积冰预冷的乙醇，冰浴 2 h
7) 于 4°C 以 5000 g 离心 l5 min，小心去除上淸液，室温晾下 RNA 沉淀. 少量水溶解RNA, 加 3 倍体积乙酔，于—70℃ 储存备用.如要除去糖蛋白和卵黄物质，则可根据需要逬行步骤 8)〜11)
8) 用少量水重溶 RNA 沉淀，加等体积经髙压灭菌的 8mol/L 氯化锂，混匀，一 20℃放置 3 h 以上。
9) 于 4℃ 以 10000 g 离心 30 min 沉淀 RNA, 小心弃上清。
10) 用 70% 乙醇洗涤沉淀，离心片刻，弃去上清液. 于空气中晾干核酸沉淀。
11) 用少量水重溶 RNA, 加 3 倍体积乙醇，于 一 70℃ 储存备用。
注意事项
1) 用氯化锂沉淀 RNA 从而有助于去除糖蛋白和卵黄物质
2) 由于此方法分离的 RNA 量大超过污染的 DNA 量，因此不必除去制品中的 DNA。尽管污染的基因组 DNA 序列不干扰杂交和翻译，但如果此 RNA 用于构建 cDNA 文库，则这些 DNA 可能会引起混乱，在这种情况下吋用无 RNA 酶的胰 DNaseI 进行消化，以去除污染的 DNA
2) 由于此方法分离的 RNA 量大超过污染的 DNA 量，因此不必除去制品中的 DNA。尽管污染的基因组 DNA 序列不干扰杂交和翻译，但如果此 RNA 用于构建 cDNA 文库，则这些 DNA 可能会引起混乱，在这种情况下吋用无 RNA 酶的胰 DNaseI 进行消化，以去除污染的 DNA
来源：丁香实验
