材料与仪器
磷酸盐缓冲溶液 硫氰酸胍溶液 CsCl TES 缓冲液 乙酸钠缓冲液 无水乙醇 经 DEFC 处理的水。
离心机 注射器及20W针头
离心机 注射器及20W针头
步骤
一 材料与设备
1) 磷酸盐缓冲溶液 (PBS)
2) 硫氰酸胍溶液：4mol/L 硫氰酸胍，0.lmmol/LTris-HClpH7.5，1%β-巯基乙醇
3)CsCl5.7mol/：L(DEPC 处理）
4)TES 缓冲液:0.1%SDS，10 mmol/LTris-ClpH7.4，lmmol/LEDTA
5)3 mmol/L 乙酸钠缓冲液 (PH5.2，DEPC 处理）
6) 无水乙醇
7) 经 DEFC 处理的水
8) 离心机
9)6 ml 注射器及 20W 针头
二 操作方法
1. 单层培养细胞
1) 室温下用 PBS 洗涤细胞，每平皿 5 ml 洗涤 2 次。
2) 在不超过 105 个细胞中加人 3.5 ml 硫氰酸胍溶液，使之遍布整个平皿。用橡胶细胞刮于擦刮平皿，回收黏稠的细胞裂解液，用装有 20-G 针头的注射器往返抽吸裂解物，舍并在一起
2. 悬浮培养细胞
1) 离心回收≤l08 个细胞，用相当于 1/2 原有体积的 PBS 重悬之，并再次离心回收细胞。
2) 往离心管中加人 3.5 ml 硫氰酸胍溶液。
3) 用装有 20-G 针头的 6 ml 注射器将黏稠的细胞裂解液往返抽吸 4 次，并将其移至一个干净的试管中。本步骤的重要性在于可对染色体 DNA 进行剪切，以降低溶液的黏度，
4) 在经硅化井高压过的 13 mmX51 mm 的超速离心管中，加人 1.5 ml 5.7mol/LCsCl 并在 CsCl 层加人 3.5 ml 细胞裂解液，界面应保持清晰。1)〜4) 步的操作均在室温进行。
5) 于 18℃，150000g 离心 12〜20 h(缓慢加速和减速）
6) 用巴斯德吸管的管尖在液面上吸取上清，管子随液面的下降而下降。当吸至仅剩约 100 ul 时，小心倒置管子, 倒出剩余液体在界面处应有一白色的 DNA 带，必须仔细地完全移去此带，因为它含有染色体 DNA。
7) 晾于沉淀约 5〜lOmin，然后以 360ul TES 溶液重溶沉淀，反复用吸管上下抽吸，如此在室温逬行 5〜l0 min，转移溶液于另一干净的微量离心管。
8) 加人 40u 13 mol/L pH5.2 的乙酸钠缓冲液和 1 ml 无水乙醇，在干冰/乙醇中沉淀 30mim，离心 10〜15 min, 用 360 ul 水重溶沉淀并重复沉淀过程。
9) 沉淀晾干 l0 min, 溶解于 20ul 水中，取 10ul 稀释至 lml，测 A260 和 A280. 最后，以水溶液或乙醇沉淀的形式在一 70℃ 储存 RNA。
1) 磷酸盐缓冲溶液 (PBS)
2) 硫氰酸胍溶液：4mol/L 硫氰酸胍，0.lmmol/LTris-HClpH7.5，1%β-巯基乙醇
3)CsCl5.7mol/：L(DEPC 处理）
4)TES 缓冲液:0.1%SDS，10 mmol/LTris-ClpH7.4，lmmol/LEDTA
5)3 mmol/L 乙酸钠缓冲液 (PH5.2，DEPC 处理）
6) 无水乙醇
7) 经 DEFC 处理的水
8) 离心机
9)6 ml 注射器及 20W 针头
二 操作方法
1. 单层培养细胞
1) 室温下用 PBS 洗涤细胞，每平皿 5 ml 洗涤 2 次。
2) 在不超过 105 个细胞中加人 3.5 ml 硫氰酸胍溶液，使之遍布整个平皿。用橡胶细胞刮于擦刮平皿，回收黏稠的细胞裂解液，用装有 20-G 针头的注射器往返抽吸裂解物，舍并在一起
2. 悬浮培养细胞
1) 离心回收≤l08 个细胞，用相当于 1/2 原有体积的 PBS 重悬之，并再次离心回收细胞。
2) 往离心管中加人 3.5 ml 硫氰酸胍溶液。
3) 用装有 20-G 针头的 6 ml 注射器将黏稠的细胞裂解液往返抽吸 4 次，并将其移至一个干净的试管中。本步骤的重要性在于可对染色体 DNA 进行剪切，以降低溶液的黏度，
4) 在经硅化井高压过的 13 mmX51 mm 的超速离心管中，加人 1.5 ml 5.7mol/LCsCl 并在 CsCl 层加人 3.5 ml 细胞裂解液，界面应保持清晰。1)〜4) 步的操作均在室温进行。
5) 于 18℃，150000g 离心 12〜20 h(缓慢加速和减速）
6) 用巴斯德吸管的管尖在液面上吸取上清，管子随液面的下降而下降。当吸至仅剩约 100 ul 时，小心倒置管子, 倒出剩余液体在界面处应有一白色的 DNA 带，必须仔细地完全移去此带，因为它含有染色体 DNA。
7) 晾于沉淀约 5〜lOmin，然后以 360ul TES 溶液重溶沉淀，反复用吸管上下抽吸，如此在室温逬行 5〜l0 min，转移溶液于另一干净的微量离心管。
8) 加人 40u 13 mol/L pH5.2 的乙酸钠缓冲液和 1 ml 无水乙醇，在干冰/乙醇中沉淀 30mim，离心 10〜15 min, 用 360 ul 水重溶沉淀并重复沉淀过程。
9) 沉淀晾干 l0 min, 溶解于 20ul 水中，取 10ul 稀释至 lml，测 A260 和 A280. 最后，以水溶液或乙醇沉淀的形式在一 70℃ 储存 RNA。
注意事项
1) 要用足够的时间去重溶沉淀，否则 RNA 的产量会有显著下降。
2) 小 RNA 在 CsCl 中离心时不能有效地沉淀，因此不能用此方法制备 5SRNA 和 tRNA 等分子。
3) 乙醇可以洗去沉淀中的氯化铯. 使沉淀易于溶解
2) 小 RNA 在 CsCl 中离心时不能有效地沉淀，因此不能用此方法制备 5SRNA 和 tRNA 等分子。
3) 乙醇可以洗去沉淀中的氯化铯. 使沉淀易于溶解
来源：丁香实验
