培养细胞RNA的提取(采用Trizol试剂盒提取RNA)

[试剂与仪器]

(1)RNA提取试剂：TRIZOL试剂(GibcolNo15596-026)

(2)DEPC处理的双蒸水，乙醇

(3)RPMI-1640，胎牛血清(FCS)，ConA(刀豆蛋白A)

(4)CO2培养箱

(5)无菌操作台和离心机等

[操作步骤]

(1)收集培养细胞，用RPMI-1600培养液离心洗涤3次，第二次离心洗涤时用RPMI-1640培养液调整细胞数至5×106~1×107细胞

(2)最后一次洗涤时吸1ml细胞悬液至1.5mlEP管中，在台式离心机离心，弃上清加入1mlTRIZOL试剂，用移液器轻轻吹打细胞数次，充分混匀，室温(15-30℃)静置5min后加入0.2ml氯仿，快速摇动15S，室温静置2-3min；

(3)于2-8℃离心14600r/min×15min，上层无色水相(RNA溶于此层中)约占整个细胞匀浆液的60%；

(4)小心吸取其中400μl移至另一Eppendorf管中，加入0.5ml异丙醇轻柔混匀，室温静置5-10min；

(5)于2-8℃离心14600r/min×10min，在管壁下底处可见一乳白色小沉淀块，即为RNA。弃上清；

(6)用冰冷75%乙醇1ml洗RNA沉淀(不用吹打沉淀)，然后于2-8℃11500r/min离心5min，去除上层乙醇后于无菌环境(或真空)风干RNA沉淀，但不要使沉淀过于干燥，以免影响RNA的溶解，用20μlDEPC处理的双蒸水溶解RNA沉淀，置-80℃冰箱备用。