关于提取RNA的资料

摘自丁香园上海孤儿的帖子，用蛋白酶K替代DEPC。

蛋白酶 K 的妙用，我曾经在别的论坛发表。坦率地说，蛋白酶 K 的这个用途，是我的得意之作之最。不是因为该发现有什么创新，而是因为它的实用性。当别人还在讨论 DEPC 有什么毒性，讨论那一家公司的 DEPC 好时，我早就在使用蛋白酶 K 替代 DEPC 实现灭活 RNase A 的目的了。[不过有一点还是要声明，我没有使用该方法制备的水用于溶解 RNA。原因不是在于我对该方法的担心，而是我没有制备高纯水 (Millipore 水) 的设备。与保存及酶反应有关的水，除了酶的残留是一个考虑因素外，水的纯度也是我考虑的；这种用途的水，我使用的是 Sigma 进口的无酶的 Millipore 水 （也不是 DEPC 处理的水）。我的用途很特殊，首先要求最高纯度的水，所以我只能付出更大的代价。]

看这篇东西，我不知道大家的最大担心是什么；最早我的最大担心是蛋白酶 K 的”尸体“是否会对后续实验产生影响。做过的实验证明我的担心是多余的。

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蛋白酶 K，威力巨大的广谱蛋白酶，95C 加热10 分钟，则完全失活。数年前首次使用它替代 DEPC 处理 RNA 抽提用的离心管和枪头，效果不错；后来又用于处理 RNase-Free的水，效果也是一级棒。从此就再也不用 DEPC 了。现在将它的细节公开，与大家分享。

配制 RNA 裂解试剂时，直接用灭菌的双蒸水配制，最后，加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀，室温放置 15 分钟后即可。

枪头及离心管去除 RNase：先将枪头及离心管清洗干净后，移入预先混好的含 1ug/ml 蛋白酶 K 的双蒸水，彻底浸入。室温放置 30 分钟后，连水一起高压灭菌。弃水后，烘干即可。

RNase-Free 水的获得：直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀，室温放置 15 分钟后，灭菌处理即可。该蛋白质的残留对后续实验没有可见的影响。

无蛋白质残留的RNase-Free 水的获得：这比较麻烦。直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀后，倒入专用的蒸馏器中。放置 15 分钟后，加热蒸馏，流出的就是无蛋白质残留的RNase-Free 水。要提醒的是，该专用蒸馏器头几次流出来的水，只能当普通蒸馏水用，因为通道中难确保 RNase-Free 的环境；另外，一定要主要密闭性，否则，流出的水又被污染了。

教你如何改善RNA提取质量

.在收获组织及细胞死亡之后，应立即灭活内源的RNA酶，以防止RNA降解。

以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活：

1）用含离液（如

胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。

2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活

3）立即将样品置于RNAlater? Tissue Collection: RNA Stabilization Solution中。它是一种水相、无毒的收集试剂，能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄（<0.5 cm），这样RNAlater才能在RNase破坏RNA之前迅速渗入组织块中。

2.使用正确的细胞或组织储存条件

在样品用液氮瞬间冻结之后，应该储存在-80°C，千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻，也会导致RNA的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉，然后置于裂解液中进行匀浆。

RNAlater使样品储存更为便利。储存在RNAlater中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期，在4°C可稳定保存长达1个月，或永久保存在-20°C。有关RNAlater的更多信息请参考 www.ambion.com/techlib/resources/RNAlater.

3.彻底匀浆样品

细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说，是一个很关键的步骤，它能够防止RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中，通过简单的涡旋震荡来匀浆；而动物组织、植物组织、酵母和细菌则常常需要更加剧烈的方法。比如说细菌的细胞壁，就需要酶消化来实现彻底的细胞裂解和RNA的最大回收。有关各种不同的样本类型，哪些方法是最适合的匀浆方法，请参考 www.ambion.com/techlib/tb/tb_183.html.

4.在RNA提取之前预处理样品裂解液

对于某些样品来说，在匀浆之后，RNA提取之前，还需要一些额外的处理步骤。对于脂肪含量高的组织，像脑组织和脂肪组织得到的裂解液，就需要通过氯仿抽提来去除脂类，从而提高RNA产量。许多植物组织中富含多酚和多糖，会降低RNA的质量和产量，用Plant RNA Isolation Aid 预处理裂解液可去除这些难以处理的成分。

5.选择最好的RNA分离方法

现有众多的RNA分离方法也许令人难以取舍。目前最简单也是最安全的方法是柱式分离，如RNAqueous? 或RNAqueous-4PCR Kit。因为操作简单，所以这些步骤特别适用于同时处理多个样品。如果是处理复杂的组织，如富含核酸酶（胰腺）或脂肪（脑和脂肪组织）的样品，就推荐使用更加严格的、基于酚处理的RNA分离方法，如ToTALLY RNA?。更多的信息请参考 www.ambion.com/techlib/tn/83/8311.html 。更多方法选择，请参考 http://www.ambion.com/techlib/trees/RNA/index.html

6.DNase处理

如果提取的RNA将用于RT-PCR，我们推荐用DNase处理纯化的RNA样品以去除残留的DNA污染。当样品来源于富含DNA的组织，如脾脏时，DNase处理也是一个好办法。Ambion的RNAqueous-4PCR Kit的实验流程中包含了DNase处理的步骤，并提供了必需的试剂（DNA酶I）。DNA-free? DNase treatment & Removal Reagents 则可用于去除用各种方法制备的RNA样品中的DNA污染。这两个产品都提供了高质量的DNase I，优化的反应缓冲液，和DNA酶消化处理后简单快速去除DNase的方法，无需使用有机溶剂和热处理。

7.减少环境RNase的暴露

为了得到完整的、高品质RNA，在整个RNA制备过程中，当RNA离开强蛋白变性剂（如离液裂解液或酚）的保护时，避免引入新的RNase污染就非常关键。由于RNase几乎是无所不在，所以必须确保与纯化的RNA接触的每一样东西都是无RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备，都必须用表面去污净化溶液如RNaseZap? 或RNaseZap Wipes 来处理过。必须保证一直使用无RNase的枪头、试管和溶液，手套也应经常更换。

8.正确的沉淀

纯化得到的RNA可能需要通过沉淀来浓缩，以满足一些下游应用的需要。醋酸铵(NH4OAc) 沉淀（加0.1体积的5 M 醋酸铵、2-2.5体积的无水乙醇，-20°C放置25分钟以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低浓度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如糖原glycogen,、酵母yeast RNA或linear acrylamide）的方法。当RNA用于RT-PCR分析时，线性的丙烯酰胺和DNase处理的糖原都可以作为理想的共沉淀剂，因为它们都不含DNA污染。酵母RNA和未处理的糖原会给样品带来核酸污染，有可能影响RT-PCR的结果。沉淀后，注意避免RNA沉淀过分干燥，因为这可能导致很难重新溶解。

9.重悬

许多RNA提取步骤的最后一步是溶解纯化的RNA沉淀。理想的重悬溶液应该满足3点要求：无RNase污染、较低的pH值（pH 6-7）、含有螯合剂，以保护RNA不受带入的RNase的降解。（THE RNA Storage Solution能满足以上所有标准。）为了帮助溶解，RNA沉淀可置于重悬溶液中在65°C孵育5分钟，并不时轻摇以帮助溶解。

10.储存

如果只是短期储存，重悬的RNA应放置于-20°C；如果是长期储存的话，就应该放置于-80°C。尽管重悬于水或缓冲液中的RNA也可以储存在-80°C，但保存于醋酸铵/乙醇溶液中的RNA沉淀则更加稳定。我们推荐将RNA溶液分装在几支管中。这会避免反复冻融损伤RNA，并预防偶然的RNase污染。

(责任编辑：大汉昆仑王)