WB 实验背景很脏是什么原因？该如何解决？

  Western Blot实验可以说是生物专业最基础的实验了，然而，虽然WB实验天天做，但是正常高清的结果图并不是你想有就能有。

  WB 实验出现最多问题的，应该就是各种背景问题了。

  你想一下，好不容易实验过五关斩六将做到最后一步，扫描结果出了，是这样的：

  为什么明明跑出了想要的趋势，但就是背景脏?怎么让自己的条带不因脏脏的背景而毁了呢?

  这里要清楚一点，背景脏不一定是因为仪器不干净造成的，也有可能是蛋白降解或者整个实验过程中条件不合适造成的，有可能是以下的环节出了问题：

  1、实验准备

  提取蛋白所需的研磨器材，以及制胶的玻璃板、梳子要清洗干净;

  若长期不使用，建议器材在实验前再行清洗一次以杜绝相应的污染。

  2、提取蛋白

  选择合适的蛋白裂解液，充分去除一些干扰因素，比如核酸，多糖，脂类等;

  建议蛋白在测量浓度后变性分装保存，避免反复冻融使蛋白发生降解;

  注意 Loading buffer 在保质期内，蛋白加入 Loading buffer 后充分混匀，再煮沸变性。

  3、制胶

  玻璃板夹紧之后，有些人习惯性加水试一下是否漏胶，建议用蒸馏水而不是自来水测试，测试结束后要将玻璃板之间的水倒干净，用滤纸吸干残留的水;

  灌胶之前要将配好的试剂充分混匀，灌胶的过程中要掌握好速度，缓慢加入，避免产生气泡；

  灌注好分离胶后，缓缓加入无水乙醇封胶，该步操作时速度一定要慢，防止胶面被冲变形;在等待分离胶凝固的过程中，不要总去摇晃观察；

  温度较高的情况下，30min 左右就会凝固，冬天气温较低可能需要较长时间；

  若分离胶液面不平，会影响后期蛋白电泳的效果。

  4、转膜

  转膜前需在转膜板两侧各放置3-4张滤纸(两侧数量相同)；

  切记不要用手直接接触 PVDF 膜和滤纸，手上的油脂会对其造成污染，务必佩戴干净的手套，全程尽量使用镊子夹取；

  转膜过程中海绵-滤纸-凝胶-PVDF 膜-滤纸-海绵每一层的气泡要排空；

  转膜时要使整个电转仪置于冰水混合物中，常用 220V 或者其他高电压进行；

  机器温度升高，会使蛋白降解，也就是转膜后，用丽春红染色发现条带跑糊，发光后条带和背景也会脏的一塌糊涂。

  5、孵育抗体

  孵育一抗的时间大多会选择 4 ℃过夜，也可以室温封闭 2 小时，4 ℃过夜效果会比室温好，4 ℃过夜具体多长时间算合适，其实没有硬性规定；

  二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育 1~2 小时，抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。

  6、发光液配置

  大部分实验室使用的 ECL 发光液，A 液和 B 液按照 1：1 的比例配置；

  发光液要求现用现配，每次根据使用量合理配置用液量；

  发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好，背景脏或者漆黑一片。