如何解决 ECL WB 非特异条带与背景问题

我最近两个月一直在做 ECL western，非常困难，都快做疯了。但是，功夫不负有心人，最终还是把困难的非特异条带和背景问题解决了。

经过此番，我总结了几条心得与大家分享：

不要用平底小盒或杂交袋，用可以旋转的杂交管（可以用 50 ml 塑料离心管做成），我刚刚得到了比较结果，效果大不一样。

膜在 blocking 前先用 stripping buffer 处理一下（当然也在杂交管中进行，注意要通过旋转使处理均匀）。我偶然发现经过该处理后背景异常干净。并经多次验证后，得出此经验。

（1）100 mM 2-ME (liquid, 14.3M)

（2）2% SDS

（3）62.5 mM Tris-HCl pH 6.7

（4）40 ml 液体包括：2-ME 0.28 ml，20% SDS 4 ml，1M Tris-HCl pH 6.7 2.5 ml，H2O 33.22 ml。

（1）将膜浸没在缓冲液中（stripping buffer）, 50-60 degree for 30 min。

（2）在 RT 中，用 TBS-T 洗脱膜 2 次，每次 10 分钟（wash the membrane for 2×10 min in TBS-T at RT）

（3）封闭

（4）上一抗

（5）上二抗

在托盘中封闭（可以室温几个小时或 4 度过夜），blocking 后，用冰冷的 TBST 洗膜 5 分钟，将膜转移到杂交管中，然后加入预冷的一抗液体，4 度过夜（旋转）。

之后将膜保持在冷室中，于平底托盘中用冰冷的 TBST 洗膜三次（在摇床上）， 然后转移到室温，再洗膜 2 次（注意尽量多加洗液）。

然后二抗室温作用 2 小时（也在杂交管中），再洗膜四次就可以显色。注意，洗膜时其实并没有必要摇得很厉害，缓摇就可以了，不会有影响。

关键是要严格保持一抗在低温下作用，抗原抗体的结合与时间和温度有关，在室温下一抗哪怕作用很短的时间或很低的浓度，也会带来不少背景的问题 。

用杂交管的目的也是为了防止由于一抗液体一直附着于膜上而导致更强的非特异性结合。如果做到了这些细节，其实抗体的稀释度都不会是很重要的问题了。

我以前找不到高背景的解决办法，把一抗稀释度调到 1：3000，二抗 1：5000，有一点效果，但不明显，况且信号也减弱得很厉害。可是现在一抗和二抗都用 1：1000，结果很好，背景低，信号反而增强了。

如果目标信号很强，可以根据信号强弱调整曝光时间来适度解决背景问题，当然如果目标信号和背景的差异不明显，这种方法是没用的。

注意：本经验特别适用于较为困难的 western blot 检测。