WB 为何又翻车？

虽然 WB 是一类基础实验，但是基础并不代表简单。翻车的主要原因在于 WB 的步骤实在繁琐：从配置蛋白胶开始，到蛋白电泳、蛋白转膜、抗体孵育，一整套流程下来花费 1～2 天的时间才能进行最后的显影。这些环节中但凡有一个出错，就会导致实验的失败。而当失败后，往往又因为步骤太多，不能明确到底是哪里出了问题。

因此，如果能够正确判读实验结果，便能精准找到犯错原因，避开 WB 实验的坑了。今天我特意整理了我的 WB 经验，对不同实验结果进行了原因分析，希望可以帮助师妹和大家把「玄学」变为有迹可循的科学。

1、跑出来的条带奇形怪状，微笑带？皱眉带？拖尾…..

出现这种情况，主要是仪器和样品的锅，在实验中要小心制胶、合理上样、正确使用电泳仪、正确转膜就能很好的避免。

2、WB 结果中背景较高

① 膜封闭时间不够，室温下通常摇床孵育膜 1h，出现这种情况可以更换合适的封闭液或者适当延长封闭的时间；

② 抗原抗体免疫过程中一抗稀释度太高，可以多设置几组一抗浓度，摸索最适宜的抗体稀释度；

③ 在整个实验过程中膜发生干燥或手套反复接触过也会发生背景值高的情况，因此实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。

3、WB 结果中有杂带干扰

① 抗体纯度不高会产生非特异性条带影响结果，高纯度抗体条带特异性更好，建议更换抗体；

② 一抗浓度过高，降低一抗稀释比，目的条带和杂带可能会减弱，有可能去掉杂带；

③ 电转后采用脱脂牛奶或 BSA 封闭，适当加长封闭时间可改善；

④ 洗膜的时候会将膜上的非目的蛋白洗脱，因此多次洗脱可以降低杂带干扰。

4、胶片空白

① 二抗的 HRP 用于信号放大和简化目标蛋白检测，其活性太强，会将底物消耗光，建议适当降低二抗浓度；

② ECM 底物中 H₂O₂ 不稳定，失活也会导致胶片空白，重新更换 ECM；

③ ECL 底物没覆盖到相应位置，可重新洗膜厚后再次曝光；

④ 抗体不匹配会导致无法精准捕捉，保证使用的抗体正确，且在有效期内。

先前于《科学报告》发表的一篇抗体测试的文章表明，针对同一靶点的很多抗体并不符合验证标准^[1]。而上述杂带干扰、胶片空白等 WB 失败案例中，基本都是因为抗体选择引起的。因此抗体质量和匹配度在 WB 实验中就显得尤为重要。高特异性、品质稳定的抗体在 WB 实验中起到重要作用。随着抗体制备技术的发展，重组单克隆抗体因其高亲和性、高特异性和可重现性的特点，代表了抗体制备技术的发展趋势。

使用 SARS-CoV-1/2 NP 抗体对感染 SARS-Cov-2 的 Vero E6 细胞进行IF分析

图片来源：ISMMS 的 Ana Fernandez-Sesma 博士实验室提供