细菌转化

一、原理

质粒 DNA 粘附在 细菌 细胞表面,经过42°C短时间的热击处理,促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素 基因表达 ,就可以在含抗菌素的培养基中生长.

二、器材

旋涡混合器 ,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml 微量 离心管 ,双面微量离心管架,干式恒温气浴（或恒温水浴锅）,制冰机, 恒温摇床 ,培养皿（已铺好固体LB-Amp）,超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温 培养箱 .

三、试剂

培养基（不加抗菌素）,LB培养基（加抗菌素）,无菌ddH2O,IPTG,X-gal.

四、实验准备

无菌ddH2O,1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）,20%IPTG（M/V）,2% X-gal（M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配）.

五、操作步骤

（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃.

（2）从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10min.

（3） 加入5μl连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng）,轻轻震荡后放置冰上20min.

（4） 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3~5min.

（5） 在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h.

（6） 在 超净工作台 中取上述转化混合液100~300μl,分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂）.

（7） 如果 载体 和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀.

（8） 在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜.

（9） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验报告.

（10）观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好.注意白色菌斑.