用蛋白A／G-琼脂糖

1. 在冰上将以下组分加入离心管，双份：

0.5～1 mg 全细胞抽提物

1 μg 抗体

5 mol/L NaCl 平衡到终浓度 100 mmol/L NaCl

免疫共沉淀缓冲液到 0.5 ml 终体积

2. 轻轻翻转离心管数次，冰上孵育 90 min。中间偶尔翻转离心管。

3. 4℃ 下最大速度离心 10 min，沉淀非特异性聚集。转移上清到新的离心管中。

4. 加 50 μl 蛋白 A 或蛋白 G-琼脂糖浆（25～30 μl 珠子体积）。确保在加到样本中之前琼脂糖浆均匀悬浮。

5. 4℃ 下旋转离心管 30～60 min。

6. 4℃ 下 1000 r/min，离心 30 s，以聚集蛋白 A/G-琼脂糖。

7. 使用 1 ml 免疫共沉淀缓冲液洗沉淀 3 次。每次洗时，离心前轻轻的翻转离心管 3 次。每次离心后，使用 20 ml 注射器和 18-G 针头吸气并去除上清。

8. 最后一次尽可能在不接触珠子的情况下吸尽所有的液体并加入 25 μl 2 × 上样缓冲液。

9. 沸水煮 5 min 准备 SDS-PAGE 电泳分析，振荡器混匀，低速离心聚集珠子。使用汉密尔顿注射器加样到 SDS-聚丙烯酰胺胶上。安排两份重复样本以预备双份的免疫印迹。电泳分离。

10. 分别使用两个不同的蛋白质的抗体作免疫印迹分析。确保包含全细胞抽提物作为比较及免疫印迹的正对照（图 19.5.1）。