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方案13 利用化学印刷法进行肽质量指纹图谱分析实验

相关实验:质谱在蛋白质组学中的应用实验

最新修订时间:

材料与仪器

细胞或所研究的蛋白质
ACTH 肽段 样品变性缓冲液 直接蓝-71 等电聚焦平衡缓冲液 碘乙酰胺 基质缓冲液 辛基-吡喃葡萄糖 修饰的猪胰蛋白酶 三丁基膦
离心机 化学打印仪 导电胶带 湿盒 固定化pH梯度胶条 MALDI 板 质谱仪 NuPAGE 离线扫描仪 PVDF 膜

步骤

一、样品的 2DPAGE 和电印迹

1.将细胞或蛋白质样品悬浮于变性缓冲液中,至浓度为 3 mg/ml,室温孵育 2 h。

2.必要时,室温条件下用 3 mmol/LTBP(以 20 mmol/L 的储存液稀释至工作浓度)还原蛋白质样品 2 h。

3.加入碘乙酰胺使蛋白质烷基化,室温条件下避光孵育 lh。

4.4°C 条件下,21000 g 离心 5 min。

5.取 115W 上清液,加到 7 cm 的 IPG 胶条上,室温条件下水化 4 h。

6.依照第 4 章方案 5(方法 A) 的步骤,进行等电聚焦(第一向分离)。整个电泳分离过程需要 36000V?h。

7.在等电聚焦平衡缓冲液中平衡胶条 20 min。

8.依照第 4 章方案 7 配制第二向 SEiS-PAGE 电泳胶。

9.依照第 4 章方案 8 的步骤处理蛋白质样品,以备第二向的 SDS-PAGE 分离。

10.将 IPG 胶条加到 4%~12% 的微型 SDS-PAGE 凝胶的顶部,依照第 4 章方案 9 进行第二向电泳。

11.依照第 4 章的方案 15 或方案 16 的步骤,电泳后以 400mA 转移 1.3 h,将蛋白质从胶上转移至 Immobilon-Psq 膜上。

12.用直接蓝-71 染色(见 Hong,etal,2000)。

13.真空干燥,然后将膜保存于密封的塑料袋中以防角蛋白污染。

二、化学打印膜的制备

14.用导电胶带(3M) 将干燥的膜粘到 MALDI 板上。

15.用离线扫描仪采集已粘到 MALDI 板上的转膜蛋白的图谱。

16.利用局部分割图像分析算法自动或用「pointandclick」方法手动检测图像上的蛋白点。

该质谱仪(ShimadzuBiotech) 带有相应的软件。

17.为在化学印刷仪上标记 MALDI 膜的相对位置,如图 8.48 选择 3 个点进行标记,用数码相机 XY 坐标定位蛋白,计算其精确位置。

三、蛋白质点的膜上自动酶解

18.编辑化学打印仪的程序,使之向膜表面自动喷洒 1%(体积分数)OGP,每个蛋白点约 1.5nl(15 滴),重复三次(总体积相当于 4.5nl)。

使用非离子去垢剂 OGP 可以确保 PVDF 膜表面的湿润,也可以作为封闭剂减少 PVDF 膜对蛋白质内切酶的吸附。

编辑化学打印仪的程序,喷洒 1nl(10 滴)200ng/ul 的膜酶(溶于 25 mmol/LNH4 HCO3) 到已覆盖 OGP 的膜表面,重复 50 次(终体积为 50nl)。如此,每个蛋白点上约有 10 ng 胰酶。

对于需以喷洒两种蛋白内切酶的同一蛋白点采集 PMF 数据的实验,则应喷洒 lg/L 聚乙烯吡咯烷酮/50%(体积分数)甲醇,每次 60 滴。

19.将印刷完毕的膜放人湿盒中,37°C 孵育 3 h。

20.酶解后,将膜重新放人化学打印仪。

21.向基质溶液中加入 50fmoles/ul ACTH。

四、MALDI-TOF-MS 分析

22.将 PVDF 膜(粘在 MALDI 板上)放人质谱仪中,然后利用 Axima-CFR 的软件 AScii2plate,将与喷涂位置相对应的坐标数据转换为 Axima-CFR 的平台定位文件 [见图 8.49(a),(b)]。

23.以正离子模式采集质量图谱。多肽离子化所用光源为 337nm 的氮激光,时间延迟提取脉冲加速电压为 25kV。

对于在某一位置内所采集的所有图谱来说,膜表面平整与否对其质量没有影响 [见图 8.49(C)]。

24.对样品的激光平均轰击次数为 50~100 次。以胰酶自酶解片段(单同位素质量为 842.51Da) 和 ACTH 肽(单同位素质量为 2465.19Da) 为标准,进行两点内标校正。

25.利用峰采集程序(Breen,etal,2000) 采集单同位素峰数据,使用 PMF 搜索引擎(该引擎搜索GenBank,www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) 或 ExPASyPeptIdent(www.expasy.ch) 来鉴定蛋白质。
大 肠 杆 菌 蛋 白 经 电 印 迹 至 膜 上 , 其 蛋 白 经 酶 解 后 进 行 M A L D I - T O F 质 谱 分 析 , 所 得 肽 指 纹 图 谱 经 搜 索 SwissProt数 据 库 , 共 鉴 定 出 5 6 种 蛋 白 ( 见 表 8. 1 4 ) 。 从 D N A 结 合 蛋 白 H - N S ( 预 测 分 子 质 量 为 1 5 5 3 0 D a ) 到 热 休 克 蛋 白 H S P - 7 0 ( 预 测 分 子 质 量 为 6 8 9 8 3 D a ) , 其 分 子 量 在 所 覆 盖 的 范 围 内 均 匀 分 布 。 蛋 白 序 列 的 平 均 覆 盖 率 为 31. 5 % , 其 中 最 高 覆 盖 率 (腺 苷 酸 激 酶 , 预 测 分 子 质 量 2 3 5 7 1 D a ) 为 6 5 . 4 % , 最 低 的 ( H S P - 7 0 , 预 测 分 子 质 量 为 6 8 9 8 3 D a ) 为 8 . 3 % 。 其 中 几 个 蛋 白 点 可 能 为 低 丰 度 蛋 白 ( 因 为 直 接 蓝 - 7 1 的 染 色 很 浅 ): 点 4 6 ( 饥 饿 胁 迫 蛋 白 , stringent starvation protein, 5 3 . 3 % 的 氨 基 酸 覆 盖 率 ), 点 7 ( 脯 氨 酰 -t R N A 合 成 酶 , 1 1 . 4 % 的 氨 基 酸 覆 盖 率 ), 点 2 3 基 因 编 码 序 列 , 2 1 . 1 % 的 氨 基 酸 覆 盖 率 )。 为 了 研 究 糖 基 化 对 糖 蛋 白 分 离 特 性 的 影 响 , 曾 对 2 D 电 印 迹 至 膜 的 人 血 浆 样 品 进 行 蛋 白 鉴 定 (图 8 . 5 1 ) 。 大 肠 杆 菌 蛋 白 的 迁 移 情 况 基 本 上 符 合 其 基 因 序 列 的 预 测 结 果 (与 其 表 观 质 量 的 相 关 系 数 为 尺 2 = 0 . 9 6 6 , 见 图 8 . 5 0 ) , 但 是 对 于 血 浆 来 源 的 糖 蛋 白 , 情 况 则 有 所 不 同 , 其 相 关 系 数 为 只 2 = 〇 . 7 4 。 鉴 于 等 电 点 通 常 难 以 测 量 , 大 肠 杆 菌 的 等 电 点 相 关 性 却 很 好 , 相 关 系 数 为 铲 = 〇 . 8 0 , 而 血 浆 蛋 白 则 基 本 上 没 有 相 关 性 , 尺2 = 〇. 3 8 。 尽 管 预 测 糖 蛋 白 的 迁 移 状 态 十 分 困 难 , 但 通 过 P M F M A L D I - T O F - M S 仍 然 鉴 定 出 了 3 2 种 蛋 白 , 其 结 果 如 表 8 . 1 5 所 示 。 这 些 蛋 白 的 分 子 量 在 T T R ( transthyretin, 甲 状 腺 素 运 载 蛋 白 , 预 测 分 子 质 量 为 1 3 7 6 1 D a ) 和 血 清 转 铁 蛋 白 ( 预 测 分 子 质 量 为 7 5 1 8 1 D a ) 之 间 分 布 。 平 均 覆 盖 率 为 3 7 % , 最 高 覆 盖 率 ( 载 脂 蛋 白 , 预 测 分 子 质 量 为 2 8 0 7 8 D a ) 为 66. 3 % , 最 低 覆 盖 率 为 U - 2 H S 糖 蛋 白 , 预 测 分 子 质 量 为 3 0 2 2 1 D a ) 为 15. 2 % 。 总 的 说 来 , 从 我 们 实 验 室 的 经 验 来 看 , 膜 上 酶 解 蛋 白 鉴 定 的 序 列 覆 盖 率 一 般 低 于 传 统 的 胶 内 消 化 法 。 原 因 有 二 , 其 一 , 胶 内 酶 解 的 作 用 面 积 一 般 比 膜 上 消 化 面 积 大 3 倍 , 分 别 为 0 . 6 m m 2 和 约 0 . 2 m m 2 ; 其 二 , 胶 内 酶 解 产 物 能 用 C 18 ZipTi p 进 行 常 规 纯 化 和 浓 缩 。 这 些 都 使 得 胶 内 酶 解 的 序 列 覆 盖 率 更 大 。 然 而 , 膜 上 酶 解 方 法 的 优 点 在 于 实 验 所 剩 蛋 白 质 的 大 部 分 还 能 够 用 于 下 一 次 实 验 , 比 如 说 , 进 行 第 二 次 内 切 蛋 白 酶 消 化 ( 见 表 8. 1 5 后 的 信 息 框 “化 学 印 刷 法 的 多 重 内 切 蛋 白 酶 反 应 ”), 或 者 利 用 测 序 级 PNGase F 和 胰 酶 酶 解 对 N 型 糖 基 化 位 点 进 行 鉴 定 ( Sloane, etal, 2 0 0 2 )


化学印刷法的多重内切蛋白酶反应 喷墨装置控制技术的发展使其能够以非常精确的体积喷射液体。因此,多重内切蛋 白酶酶解可于多个蛋白质点上同时进行。人类血浆样品通过11c m 、 pl= 5 〜6. 5 的 IPG 胶条分离,其中载脂蛋白A -W 和触珠蛋白P-链可以明显地分开开来( 见图8. 52),两者 利用化学印刷法可以进行分析鉴定,所用蛋白酶分别为蛋白内切酶Glu-C和胰蛋白酶, 两个印刷点在图8: 5 2 中示出。 虽然基质溶液溶于乙腈有助于喷洒,但是由于乙腈的非极性特性,使得基质溶液容 易在膜上弥散。由于化学印刷点的文件和Axitna-CFR M A L D I 分 级 文 件 ( stagefile) 之 间在标记方面存在着细微误差,以及M A L D I 激光光束的直径大小( 约 ll〇 M m ) 也有所 变化,我们发现将膜表面的多重酶解产物用微型C 18SpTip (Millipore) 处理比将其直接 用于Axima-CFR M A L D I -T 0 F - M S 测定的效果更好。肽段从微型Q 8 ZipTip上直接洗脱到 A x i m a - C F R M A L D I 板上,依据所得P M F 数据,胰酶处理的序列覆盖率为29.8%,蛋白 内切酶Glu-C对应为21. 5% ,总的氨基酸覆盖率为41. 2% (见图8. 52)。覆盖率增加,两 种酶酶解所得结果的匹配又可以相互印证,这都增加了蛋白质鉴定的可靠性。

来源:丁香实验

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