材料与仪器
ACTH 肽段 样品变性缓冲液 直接蓝-71 等电聚焦平衡缓冲液 碘乙酰胺 基质缓冲液 辛基-吡喃葡萄糖 修饰的猪胰蛋白酶 三丁基膦
离心机 化学打印仪 导电胶带 湿盒 固定化pH梯度胶条 MALDI 板 质谱仪 NuPAGE 离线扫描仪 PVDF 膜
步骤
一、样品的 2DPAGE 和电印迹
1.将细胞或蛋白质样品悬浮于变性缓冲液中,至浓度为 3 mg/ml,室温孵育 2 h。
2.必要时,室温条件下用 3 mmol/LTBP(以 20 mmol/L 的储存液稀释至工作浓度)还原蛋白质样品 2 h。
3.加入碘乙酰胺使蛋白质烷基化,室温条件下避光孵育 lh。
4.4°C 条件下,21000 g 离心 5 min。
5.取 115W 上清液,加到 7 cm 的 IPG 胶条上,室温条件下水化 4 h。
6.依照第 4 章方案 5(方法 A) 的步骤,进行等电聚焦(第一向分离)。整个电泳分离过程需要 36000V?h。
7.在等电聚焦平衡缓冲液中平衡胶条 20 min。
8.依照第 4 章方案 7 配制第二向 SEiS-PAGE 电泳胶。
9.依照第 4 章方案 8 的步骤处理蛋白质样品,以备第二向的 SDS-PAGE 分离。
10.将 IPG 胶条加到 4%~12% 的微型 SDS-PAGE 凝胶的顶部,依照第 4 章方案 9 进行第二向电泳。
11.依照第 4 章的方案 15 或方案 16 的步骤,电泳后以 400mA 转移 1.3 h,将蛋白质从胶上转移至 Immobilon-Psq 膜上。
12.用直接蓝-71 染色(见 Hong,etal,2000)。
13.真空干燥,然后将膜保存于密封的塑料袋中以防角蛋白污染。
二、化学打印膜的制备
14.用导电胶带(3M) 将干燥的膜粘到 MALDI 板上。
15.用离线扫描仪采集已粘到 MALDI 板上的转膜蛋白的图谱。
16.利用局部分割图像分析算法自动或用「pointandclick」方法手动检测图像上的蛋白点。
该质谱仪(ShimadzuBiotech) 带有相应的软件。
17.为在化学印刷仪上标记 MALDI 膜的相对位置,如图 8.48 选择 3 个点进行标记,用数码相机 XY 坐标定位蛋白,计算其精确位置。
三、蛋白质点的膜上自动酶解
18.编辑化学打印仪的程序,使之向膜表面自动喷洒 1%(体积分数)OGP,每个蛋白点约 1.5nl(15 滴),重复三次(总体积相当于 4.5nl)。
使用非离子去垢剂 OGP 可以确保 PVDF 膜表面的湿润,也可以作为封闭剂减少 PVDF 膜对蛋白质内切酶的吸附。
编辑化学打印仪的程序,喷洒 1nl(10 滴)200ng/ul 的膜酶(溶于 25 mmol/LNH4 HCO3) 到已覆盖 OGP 的膜表面,重复 50 次(终体积为 50nl)。如此,每个蛋白点上约有 10 ng 胰酶。
对于需以喷洒两种蛋白内切酶的同一蛋白点采集 PMF 数据的实验,则应喷洒 lg/L 聚乙烯吡咯烷酮/50%(体积分数)甲醇,每次 60 滴。
19.将印刷完毕的膜放人湿盒中,37°C 孵育 3 h。
20.酶解后,将膜重新放人化学打印仪。
21.向基质溶液中加入 50fmoles/ul ACTH。
四、MALDI-TOF-MS 分析
22.将 PVDF 膜(粘在 MALDI 板上)放人质谱仪中,然后利用 Axima-CFR 的软件 AScii2plate,将与喷涂位置相对应的坐标数据转换为 Axima-CFR 的平台定位文件 [见图 8.49(a),(b)]。
23.以正离子模式采集质量图谱。多肽离子化所用光源为 337nm 的氮激光,时间延迟提取脉冲加速电压为 25kV。
对于在某一位置内所采集的所有图谱来说,膜表面平整与否对其质量没有影响 [见图 8.49(C)]。
24.对样品的激光平均轰击次数为 50~100 次。以胰酶自酶解片段(单同位素质量为 842.51Da) 和 ACTH 肽(单同位素质量为 2465.19Da) 为标准,进行两点内标校正。
25.利用峰采集程序(Breen,etal,2000) 采集单同位素峰数据,使用 PMF 搜索引擎(该引擎搜索GenBank,www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) 或 ExPASyPeptIdent(www.expasy.ch) 来鉴定蛋白质。
来源:丁香实验