肽质量指纹图谱—MALDI-TOF 法鉴定蛋白质
丁香园
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1. 前言
值得注意的是，蛋白质质谱（MS) 鉴定是在 20 世纪 80 年代后期基于 “ 软” 电离技术发展起来的，这些电离技术包括欧洲 Michael Karas 和 Franz Hillenkamp 开发的基质辅助激光解吸电离（MALDI ) 和美国 John Fenn 开发的电喷雾电离（ESI )。JohnFenn 和 Takana 由于开发了 “软解吸电离方法应用于生物大分子的质谱分析” ，而获得了 2002 年诺贝尔化学奖。
由于蛋白质提取物能充分分离和兼容二维凝胶的染色（见第 16 章和第 17 章），因此适合于通过 MS 进行蛋白质鉴定。然而，整个蛋白质的 MS 不等于蛋白质的直接鉴定。要达到灵敏度高、准确度好并能访问大部分数据（ 覆盖序列），蛋白质必须由内切蛋白酶（endoprotease) 消化产生多种蛋白质的特定片段。如果内切蛋白酶有足够的特异性、数据库中有蛋白质的信息，则通过对实验样品肽质量（由内切蛋白酶消化产生、通过 MALDI-TOF 质谱检测）与数据库中所有蛋白质硅片消化的肽质量的推断比较，就能对候选蛋白质进行鉴定。
植物蛋白质组学使用的技术类似于其他蛋白质组研究。然而，特别要注意样品生物起源的特殊性。事实上，与动物基因组相比，植物的基因组较大（通常为多倍体），目前只有少量的植物基因组已经完成了测序和注释。拟南芥是第一个完成基因组测序的植物（2000 年 12 月）。对于没有测序的植物，也许可以获得部分蛋白质信息；但对于大多数植物 [ 主要是木本和谷类（除了水稻）植物 ] 来说，基因组信息很少。因此对于没有测序的品种，也许可以通过同源性比较对蛋白质进行鉴定。对于未鉴定的蛋白质，MS/MS 肽测序可能是鉴定蛋白质的唯一有效方法（无论是 MALDI-TOF/TOF 还是纳米液相色谱法 [ ( LC ) -ESI-MS/MS] 。此外，不能首先使用植物特定的数据库，这是因为大部分蛋白质污染有人或哺乳动物的信息。
实验步骤如下所述。
( 1 ) 从凝胶上切除蛋白点，用胰蛋白酶进行凝胶消化（见 19.3.1)。
( 2 ) 将消化的样品沉积 MALDI 标基上，MALDI-TOF 谱获取信息并进行注释 ( 见 19.3.2)。
( 3 ) 数据库搜索，仔细查验搜索匹配的片段（见 19.3.3)。
值得注意的是，蛋白质质谱（MS) 鉴定是在 20 世纪 80 年代后期基于 “ 软” 电离技术发展起来的，这些电离技术包括欧洲 Michael Karas 和 Franz Hillenkamp 开发的基质辅助激光解吸电离（MALDI ) 和美国 John Fenn 开发的电喷雾电离（ESI )。JohnFenn 和 Takana 由于开发了 “软解吸电离方法应用于生物大分子的质谱分析” ，而获得了 2002 年诺贝尔化学奖。
由于蛋白质提取物能充分分离和兼容二维凝胶的染色（见第 16 章和第 17 章），因此适合于通过 MS 进行蛋白质鉴定。然而，整个蛋白质的 MS 不等于蛋白质的直接鉴定。要达到灵敏度高、准确度好并能访问大部分数据（ 覆盖序列），蛋白质必须由内切蛋白酶（endoprotease) 消化产生多种蛋白质的特定片段。如果内切蛋白酶有足够的特异性、数据库中有蛋白质的信息，则通过对实验样品肽质量（由内切蛋白酶消化产生、通过 MALDI-TOF 质谱检测）与数据库中所有蛋白质硅片消化的肽质量的推断比较，就能对候选蛋白质进行鉴定。
植物蛋白质组学使用的技术类似于其他蛋白质组研究。然而，特别要注意样品生物起源的特殊性。事实上，与动物基因组相比，植物的基因组较大（通常为多倍体），目前只有少量的植物基因组已经完成了测序和注释。拟南芥是第一个完成基因组测序的植物（2000 年 12 月）。对于没有测序的植物，也许可以获得部分蛋白质信息；但对于大多数植物 [ 主要是木本和谷类（除了水稻）植物 ] 来说，基因组信息很少。因此对于没有测序的品种，也许可以通过同源性比较对蛋白质进行鉴定。对于未鉴定的蛋白质，MS/MS 肽测序可能是鉴定蛋白质的唯一有效方法（无论是 MALDI-TOF/TOF 还是纳米液相色谱法 [ ( LC ) -ESI-MS/MS] 。此外，不能首先使用植物特定的数据库，这是因为大部分蛋白质污染有人或哺乳动物的信息。
实验步骤如下所述。
( 1 ) 从凝胶上切除蛋白点，用胰蛋白酶进行凝胶消化（见 19.3.1)。
( 2 ) 将消化的样品沉积 MALDI 标基上，MALDI-TOF 谱获取信息并进行注释 ( 见 19.3.2)。
( 3 ) 数据库搜索，仔细查验搜索匹配的片段（见 19.3.3)。
