膜蛋白的分离、鉴定及其功能分析—GFC/IEC/SDS-PAGE 和 MALDI-TOF-MS 方法
相关实验：膜蛋白的分离、鉴定及其功能分析—GFC/IEC/SDS-PAGE 和 MALDI-TOF-MS 实验
最新修订时间：
材料与仪器
分离缓冲液 增溶缓冲液 洗脱缓冲液 Laemmli 样品缓冲液 胶段冲洗缓冲液 酶解缓冲液 肽抽提缓冲液
步骤
3.1 膜的分离
因为在研磨材料时，要分离的膜组分以小囊泡形式与可溶的胞质蛋白质混合在一起，所以，最好在分离、鉴定膜蛋白前将这些胞质蛋白质去除掉。为了达到这个目的，我们需要用可穿透这些囊泡的达到临界微胞浓度（CMC) 的去垢剂溶液来分离膜组分( 见注释 1) ，使包覆亲水性蛋白质慢慢地向外扩散。增溶缓冲液还含有一种离液盐和一种二价金属螯合剂用来解离松散结合在膜周边的蛋白质。这里所介绍的分离植物质膜的实验过程见图 22-1。
( 1 ) 将 0.5~5 mg 的膜组分悬浮在分离缓冲液中（浓度为：0.2 mg/ml) ，4°C 搅拌混匀。
( 2 ) 测试时间可长达 4 h。
( 3 ) 经过处理后，将膜悬浮液于 4°C，100000 g 离心 1h。
( 4 ) 测定上清液和沉淀的蛋白质含量。
( 5 ) 在 SDS-PAGE 上分析膜外周蛋白质组分（上清液）和膜内镶嵌蛋白质组分 ( 沉淀）的条带。
3.2 蛋白质增溶
分离膜镶嵌蛋白质首先需要使用去垢剂打破其天然脂环境 [ 8，9] 。这里介绍的方法中，我们使用中性或两性离子去垢剂，因为这两种去垢剂不会修饰由 IEC 分离出来的蛋白质的电荷。而且这两种去垢剂作用温和，能保持蛋白质的天然构象与活性。
( 1 ) 用 1 ml 增溶缓冲液室温下增溶 0.5~5 mg 分离出来的膜组分。
( 2 ) 添加 1 ml DM 溶液于增溶缓冲液中，使 DM/蛋白质比例（m/m) 达到 3~7 ( 见注释 2) 。
( 3 ) 涡旋混匀 2 min，室温下低速搅拌，增溶处理 2 h。
( 4 ) 室温下 190000 g 离心 1 h。
( 5 ) 定量分析上清液和沉淀中的蛋白质，获得增溶产量。
( 6 ) 在 SDS-PAGE 上分析溶解蛋白质（上清液）和不溶解蛋白质（沉淀）的条带。
经过这些步骤可获得与初始 PM 蛋白质很相似的溶解蛋白质的 SDS-PAGE 图谱 ( 图 22-2)，约有 85% 的初始蛋白质可经上述实验过程溶解出来。
3.3 色谱层析
1. IEC/SDS-PAGE 分离
使用 Mono Q HR 5/5 层析柱（Pharmacia/Amersham Biosciences 公司）进行阴离子交换色谱层析（A EC，见注释 3) ，在整个层析过程中，用 280 nm 吸收监测蛋白质洗脱，并设定组分收集容积为 0.3 ml。样品和洗脱缓冲液中的去垢剂容易在管道系统中形成泡泡，因此，建议小心超声处理（30 min ) 缓冲液和调整洗脱速度（0.5~1 ml/min) 。
( 1 ) 室温下，用 15 ml 洗脱缓冲液平衡层析柱。
( 2 ) 将新增溶出来的蛋白质（0.5~2 mg 蛋白质，2 ml 溶液）上样到层析柱上，当收集组分时，用 5 ml 洗脱缓冲液冲洗柱子。
( 3 ) 用 10~15 ml 线性盐梯度（在洗脱缓冲液中含 0~1 mol/L NaCl 盐浓度）洗脱蛋白质。
( 4 ) 用 5 ml 含有 1 mol/L NaCl 的洗脱缓冲液冲洗柱子，将柱子里的残留样品洗出。
( 5 ) 在收集的组分中加入冷丙酮 [ -20°C，80% ( V/V) ] ，于 -20°C 下过夜，用以沉淀蛋白质。
( 6 ) 用微量离心机 4°C 条件下 17000 g 离心 30 min。
( 7 ) 在上述用丙酮沉淀的蛋白质样品中加入 50 μl 的 Laemmli 样品缓冲液，涡旋振荡，并超声波振荡处理（超声波水浴中处理 15 min) ，重悬沉淀的蛋白质。
( 8 ) 用 SDS-PAGE 分离蛋白质条带。
具代表性的 IEC/SDS-PAGE 分离方法（从 0.5 mg 酵母质膜增溶出来的蛋白质幵始）见图 22-3A。我们可以看到 3~6 个连续收集的组分中都含有同一条带，用 MALDI-TOF/MS 可以从 70% 的电泳条带中鉴定出一个蛋白质，从 5%~25% 的条带中鉴定 2 个或 3 个蛋白质（图 22-3B) 。比较连续排列的不同处理的同梯度洗脱下来的阴离子交换层析（AEC ) 组分的 SDS-PAGE 泳道来进行数据分析。
2. GFC/AEC/SDS-PAGE Separation
分离复杂的蛋白质混合物，如膜粗提物，需要两个连续的色谱层析步骤。因此，必须获得较大量（约 5 mg) 的增溶蛋白质样品。这也有利于低丰度的蛋白质在 SDS-PAGE 电泳泳道上被分辨出来。由于分子筛色谱层析（GFC) 会稀释样品，因此它被用在第一步的色谱层析，经 GFC 层析后被稀释的样品经第二步的离子交换层析（IEC ) 后得到浓缩。下面介绍的是，拟南芥膜增溶蛋白用 Superdex 200 Highload 16/60 层析柱进行的 GFC 色谱层析实验（见注释 5) 。
( 1 ) 用 180 ml 洗脱缓冲液，1 ml/min 流速，室温下平衡 GFC 层析柱。
( 2 ) 将新增溶的蛋白质样品进样到层析柱上。
( 3 ) 用 180 ml 洗脱缓冲液洗脱蛋白（0.5 ml/min) ，并设置 0.3 ml 的收集组分容积。
( 4 ) 将邻近组分中蛋白质含量低于 500 μg ( 根据 280 nm 吸收估计的量）的组分合并在一起（见注释 6) 。
( 5 ) 取 100 μg GFC 分离组分样品，加入冷丙酮 [ -20°C，80% (V/V)] ，于 -20°C 下过夜，用以沉淀蛋白质。
( 6 ) 用微量离心机 4°C 下 17000 g 离心 30 min。
( 7 ) 在上述用丙酮沉淀的蛋白质样品中加入 50 μl Laemmli 样品缓冲液，涡旋振荡，并超声波振荡处理（超声波水浴中处理 15 min) ，重悬沉淀的蛋白质。
( 8 ) 按前述方法用 SDS-PAGE 分离 GFC 洗脱组分的蛋白质。
( 9 ) 按前述方法将上述的 GFC 分离出来的组分样品（至少含 500 μg 的蛋白质）进行第二步 AEC 色谱层析，使用 Mono Q HR 5/5 ( Pharmacia/Amersham Biosciences 公司）。
膜粗提物经 GFC/SDS-PAGE 分离后，得到较为复杂的蛋白图谱，特别是在 40~70 kDa 区域内（图 22-4)。当经过 GFC/AEC/SDSPAGE 分离后，可得到较为简单的蛋白质图谱（图 22-5)，易于用 MALDI-TOF/MS 鉴定蛋白质（切下的蛋白质条带含较少的蛋白质)。
3.4 胰蛋白酶胶内蛋白消化
( 1 ) 切下考马斯亮蓝染色的条带。
( 2 ) 用 2 ml ( 在 2 ml 离心管中）洗胶液充分冲洗切下来的胶粒至完全褪色，一般来说，两次 4 h 的脱色冲洗可完全脱去胶粒的颜色。
( 3 ) 将褪色的胶粒在纯乙腈溶液中脱水处理 1 h。
( 4 ) 用真空干燥器完全干燥胶粒（30 min)。
( 5 ) 4°C 条件下，用消化缓冲液制备新鲜的胰蛋白酶溶液（0.02 μg/μl)，防止酶的自身消化，置冰上备用。
( 6 ) 将干燥的胶粒置于小离心管中，滴入 15 μl 的胰蛋白酶溶液，将管子插入冰中，水化胶粒。30 min 后，胶粒上只有薄薄的一层胰蛋白酶溶液。当初始加入的胰蛋白酶液滴被胶粒完全吸收后，加入 15 mmol/L 碳酸氢铵缓冲液，使胶粒周围包裹一层薄薄的碳酸氢铵。如果初始加入的胰蛋白酶溶液未被胶粒完全吸收，吸出多余的胰蛋白酶溶液，使胶粒周围只有一层薄薄的胰蛋白酶（见注释 7) 。
( 7 ) 将装有胶粒的离心管封口，37°C 至少保温 5 h，也可保温过夜。
( 8 ) 加入 150 μl 肽段萃取缓冲液，20°C 保温 3 h。
( 9 ) 去掉胶粒，用真空干燥器将 500 μl 离心管中的肽段萃取液浓缩至 5 μl。千万不要将肽段萃取液完全干燥，因为那样会使肽段吸附在管壁上而洗不下来。
3.5 MALDI-TOF/MS
在本书介绍的通用步骤（见第 19 章）之后，蛋白质将在靶上结晶，这里简单阐述如下：
( 1 ) 用半饱和的 1:1 乙腈/水溶液新鲜配制 α-氰基-4-羟基肉桂酸，并用 0.1% TFA 酸化。
( 2 ) 将 0.8 μl 的蛋白质样品与 0.8 μl 的基质混合，并立即点样到靶上。
( 3 ) 让样品在靶上干燥和结晶。
( 4 ) 用超纯水冲洗靶后，让其干燥。
当谱图稳定后，读取谱图（200~300 次激光轰击，见注释 8)。
3.6 数据库检索
现在有许多不同的搜索引擎可以用来鉴定已获得肽质量的蛋白质，ProFound [10] 能够很好地用来进行蛋白质混合样品（最多可达 4 种蛋白质）的鉴定。在我们的分析中，总是假设为混合样品（虽然也会出现最终的鉴定结果表示只有一种蛋白质)。检索所用的参数如下：合适的物种分类范畴（拟南芥或酿酒酵母）；质量误差为 0.1 Da ( 允许肽段质量偏离校准范围的最大值 )；允许 1 个酶切缺失位点；蛋白质分子质量范围：0~1000 kDa；pI 范围：0~14；氨基酸未被化学修饰。考虑到混合物中可能存在的蛋白质种类的数量，可以进行最多 4 次改变可能的蛋白质的数量设置（最大设置为 4)。存取检索运行中获得的最高分值的结果。对于每个鉴定的蛋白质，实验匹配质量用在最终的 ProFound “ 单个蛋白质” 检索。最后，那些可能性接近 1，且 Z 分值高于 1.65 的蛋白质才予以考虑。
因为在研磨材料时，要分离的膜组分以小囊泡形式与可溶的胞质蛋白质混合在一起，所以，最好在分离、鉴定膜蛋白前将这些胞质蛋白质去除掉。为了达到这个目的，我们需要用可穿透这些囊泡的达到临界微胞浓度（CMC) 的去垢剂溶液来分离膜组分( 见注释 1) ，使包覆亲水性蛋白质慢慢地向外扩散。增溶缓冲液还含有一种离液盐和一种二价金属螯合剂用来解离松散结合在膜周边的蛋白质。这里所介绍的分离植物质膜的实验过程见图 22-1。
( 1 ) 将 0.5~5 mg 的膜组分悬浮在分离缓冲液中（浓度为：0.2 mg/ml) ，4°C 搅拌混匀。
( 2 ) 测试时间可长达 4 h。
( 3 ) 经过处理后，将膜悬浮液于 4°C，100000 g 离心 1h。
( 4 ) 测定上清液和沉淀的蛋白质含量。
( 5 ) 在 SDS-PAGE 上分析膜外周蛋白质组分（上清液）和膜内镶嵌蛋白质组分 ( 沉淀）的条带。
3.2 蛋白质增溶
分离膜镶嵌蛋白质首先需要使用去垢剂打破其天然脂环境 [ 8，9] 。这里介绍的方法中，我们使用中性或两性离子去垢剂，因为这两种去垢剂不会修饰由 IEC 分离出来的蛋白质的电荷。而且这两种去垢剂作用温和，能保持蛋白质的天然构象与活性。
( 1 ) 用 1 ml 增溶缓冲液室温下增溶 0.5~5 mg 分离出来的膜组分。
( 2 ) 添加 1 ml DM 溶液于增溶缓冲液中，使 DM/蛋白质比例（m/m) 达到 3~7 ( 见注释 2) 。
( 3 ) 涡旋混匀 2 min，室温下低速搅拌，增溶处理 2 h。
( 4 ) 室温下 190000 g 离心 1 h。
( 5 ) 定量分析上清液和沉淀中的蛋白质，获得增溶产量。
( 6 ) 在 SDS-PAGE 上分析溶解蛋白质（上清液）和不溶解蛋白质（沉淀）的条带。
经过这些步骤可获得与初始 PM 蛋白质很相似的溶解蛋白质的 SDS-PAGE 图谱 ( 图 22-2)，约有 85% 的初始蛋白质可经上述实验过程溶解出来。
3.3 色谱层析
1. IEC/SDS-PAGE 分离
使用 Mono Q HR 5/5 层析柱（Pharmacia/Amersham Biosciences 公司）进行阴离子交换色谱层析（A EC，见注释 3) ，在整个层析过程中，用 280 nm 吸收监测蛋白质洗脱，并设定组分收集容积为 0.3 ml。样品和洗脱缓冲液中的去垢剂容易在管道系统中形成泡泡，因此，建议小心超声处理（30 min ) 缓冲液和调整洗脱速度（0.5~1 ml/min) 。
( 1 ) 室温下，用 15 ml 洗脱缓冲液平衡层析柱。
( 2 ) 将新增溶出来的蛋白质（0.5~2 mg 蛋白质，2 ml 溶液）上样到层析柱上，当收集组分时，用 5 ml 洗脱缓冲液冲洗柱子。
( 3 ) 用 10~15 ml 线性盐梯度（在洗脱缓冲液中含 0~1 mol/L NaCl 盐浓度）洗脱蛋白质。
( 4 ) 用 5 ml 含有 1 mol/L NaCl 的洗脱缓冲液冲洗柱子，将柱子里的残留样品洗出。
( 5 ) 在收集的组分中加入冷丙酮 [ -20°C，80% ( V/V) ] ，于 -20°C 下过夜，用以沉淀蛋白质。
( 6 ) 用微量离心机 4°C 条件下 17000 g 离心 30 min。
( 7 ) 在上述用丙酮沉淀的蛋白质样品中加入 50 μl 的 Laemmli 样品缓冲液，涡旋振荡，并超声波振荡处理（超声波水浴中处理 15 min) ，重悬沉淀的蛋白质。
( 8 ) 用 SDS-PAGE 分离蛋白质条带。
具代表性的 IEC/SDS-PAGE 分离方法（从 0.5 mg 酵母质膜增溶出来的蛋白质幵始）见图 22-3A。我们可以看到 3~6 个连续收集的组分中都含有同一条带，用 MALDI-TOF/MS 可以从 70% 的电泳条带中鉴定出一个蛋白质，从 5%~25% 的条带中鉴定 2 个或 3 个蛋白质（图 22-3B) 。比较连续排列的不同处理的同梯度洗脱下来的阴离子交换层析（AEC ) 组分的 SDS-PAGE 泳道来进行数据分析。
2. GFC/AEC/SDS-PAGE Separation
分离复杂的蛋白质混合物，如膜粗提物，需要两个连续的色谱层析步骤。因此，必须获得较大量（约 5 mg) 的增溶蛋白质样品。这也有利于低丰度的蛋白质在 SDS-PAGE 电泳泳道上被分辨出来。由于分子筛色谱层析（GFC) 会稀释样品，因此它被用在第一步的色谱层析，经 GFC 层析后被稀释的样品经第二步的离子交换层析（IEC ) 后得到浓缩。下面介绍的是，拟南芥膜增溶蛋白用 Superdex 200 Highload 16/60 层析柱进行的 GFC 色谱层析实验（见注释 5) 。
( 1 ) 用 180 ml 洗脱缓冲液，1 ml/min 流速，室温下平衡 GFC 层析柱。
( 2 ) 将新增溶的蛋白质样品进样到层析柱上。
( 3 ) 用 180 ml 洗脱缓冲液洗脱蛋白（0.5 ml/min) ，并设置 0.3 ml 的收集组分容积。
( 4 ) 将邻近组分中蛋白质含量低于 500 μg ( 根据 280 nm 吸收估计的量）的组分合并在一起（见注释 6) 。
( 5 ) 取 100 μg GFC 分离组分样品，加入冷丙酮 [ -20°C，80% (V/V)] ，于 -20°C 下过夜，用以沉淀蛋白质。
( 6 ) 用微量离心机 4°C 下 17000 g 离心 30 min。
( 7 ) 在上述用丙酮沉淀的蛋白质样品中加入 50 μl Laemmli 样品缓冲液，涡旋振荡，并超声波振荡处理（超声波水浴中处理 15 min) ，重悬沉淀的蛋白质。
( 8 ) 按前述方法用 SDS-PAGE 分离 GFC 洗脱组分的蛋白质。
( 9 ) 按前述方法将上述的 GFC 分离出来的组分样品（至少含 500 μg 的蛋白质）进行第二步 AEC 色谱层析，使用 Mono Q HR 5/5 ( Pharmacia/Amersham Biosciences 公司）。
膜粗提物经 GFC/SDS-PAGE 分离后，得到较为复杂的蛋白图谱，特别是在 40~70 kDa 区域内（图 22-4)。当经过 GFC/AEC/SDSPAGE 分离后，可得到较为简单的蛋白质图谱（图 22-5)，易于用 MALDI-TOF/MS 鉴定蛋白质（切下的蛋白质条带含较少的蛋白质)。
3.4 胰蛋白酶胶内蛋白消化
( 1 ) 切下考马斯亮蓝染色的条带。
( 2 ) 用 2 ml ( 在 2 ml 离心管中）洗胶液充分冲洗切下来的胶粒至完全褪色，一般来说，两次 4 h 的脱色冲洗可完全脱去胶粒的颜色。
( 3 ) 将褪色的胶粒在纯乙腈溶液中脱水处理 1 h。
( 4 ) 用真空干燥器完全干燥胶粒（30 min)。
( 5 ) 4°C 条件下，用消化缓冲液制备新鲜的胰蛋白酶溶液（0.02 μg/μl)，防止酶的自身消化，置冰上备用。
( 6 ) 将干燥的胶粒置于小离心管中，滴入 15 μl 的胰蛋白酶溶液，将管子插入冰中，水化胶粒。30 min 后，胶粒上只有薄薄的一层胰蛋白酶溶液。当初始加入的胰蛋白酶液滴被胶粒完全吸收后，加入 15 mmol/L 碳酸氢铵缓冲液，使胶粒周围包裹一层薄薄的碳酸氢铵。如果初始加入的胰蛋白酶溶液未被胶粒完全吸收，吸出多余的胰蛋白酶溶液，使胶粒周围只有一层薄薄的胰蛋白酶（见注释 7) 。
( 7 ) 将装有胶粒的离心管封口，37°C 至少保温 5 h，也可保温过夜。
( 8 ) 加入 150 μl 肽段萃取缓冲液，20°C 保温 3 h。
( 9 ) 去掉胶粒，用真空干燥器将 500 μl 离心管中的肽段萃取液浓缩至 5 μl。千万不要将肽段萃取液完全干燥，因为那样会使肽段吸附在管壁上而洗不下来。
3.5 MALDI-TOF/MS
在本书介绍的通用步骤（见第 19 章）之后，蛋白质将在靶上结晶，这里简单阐述如下：
( 1 ) 用半饱和的 1:1 乙腈/水溶液新鲜配制 α-氰基-4-羟基肉桂酸，并用 0.1% TFA 酸化。
( 2 ) 将 0.8 μl 的蛋白质样品与 0.8 μl 的基质混合，并立即点样到靶上。
( 3 ) 让样品在靶上干燥和结晶。
( 4 ) 用超纯水冲洗靶后，让其干燥。
当谱图稳定后，读取谱图（200~300 次激光轰击，见注释 8)。
3.6 数据库检索
现在有许多不同的搜索引擎可以用来鉴定已获得肽质量的蛋白质，ProFound [10] 能够很好地用来进行蛋白质混合样品（最多可达 4 种蛋白质）的鉴定。在我们的分析中，总是假设为混合样品（虽然也会出现最终的鉴定结果表示只有一种蛋白质)。检索所用的参数如下：合适的物种分类范畴（拟南芥或酿酒酵母）；质量误差为 0.1 Da ( 允许肽段质量偏离校准范围的最大值 )；允许 1 个酶切缺失位点；蛋白质分子质量范围：0~1000 kDa；pI 范围：0~14；氨基酸未被化学修饰。考虑到混合物中可能存在的蛋白质种类的数量，可以进行最多 4 次改变可能的蛋白质的数量设置（最大设置为 4)。存取检索运行中获得的最高分值的结果。对于每个鉴定的蛋白质，实验匹配质量用在最终的 ProFound “ 单个蛋白质” 检索。最后，那些可能性接近 1，且 Z 分值高于 1.65 的蛋白质才予以考虑。
来源：丁香实验
