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膜蛋白的分离、鉴定及其功能分析—GFC/IEC/SDS-PAGE 和 MALDI-TOF-MS 方法

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1. 前言

植物模式基因组测序和功能鉴定的研究成果以及快速增长的许多植物序列的数据 [1,2 ] ,使得用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI -TOF- MS ) 获得的肽质量指纹谱来鉴定蛋白质变得轻而易举。这种方法具有高灵敏度、高通量和低成本特点,但需要前期的蛋白质分离。由于膜镶嵌蛋白质在第一相的等电聚焦 (IEF ) 电泳中沉淀,目前最常用的以高分辨率解析从细胞中提取的蛋白质的二维凝胶电泳技术还不适于完全分离膜蛋白质组 ( 见第 11 章),相比之下,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳可有效分离膜镶嵌蛋白质。

下面要介绍的方法是以离子交换层析替代 2D-GE 电泳中 IEF,如果样品量充足,还可以辅以凝胶过滤色谱层析 [7] 。最终用 SDS-PAGE 电泳进一步分离膜镶嵌蛋白质。经过上述这些分离过程,许多膜镶嵌蛋白的胶内酶解和 MALDI-TOF/MS 分析获得了成功。

这个方法的目标之一是在一个单一的实验构架内,分离膜组分中不同类别的蛋白质,包括大部分的疏水、酸性和碱性蛋白。它们可通过染色胶和 MALDI-TOF/MS 蛋白质指纹谱进行蛋白质分析。本章节介绍的方法可能不能直接应用在其他材料上,但这些方法可以为读者在进行其他材料的实验过程中提供优化指导。



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