利用寡核苷酸延伸法进行纯化DNA片段的放射性标记

 

   随机引物法：利用寡核苷酸延伸法进行纯化 DNA 片段的放射性标记

 

1.      在一个 0.5ml 的微量离心管中加入溶于 30 μ l 水的模板 DNA(25ng) 及 1 μ l 随机脱氧核苷酸引物（约 125ng ）。盖紧微量离心管，置于沸水浴中 2min 。

2.      将微量离心管移至冰上放置 1min ， 4 ℃下离心 10s 使引物与模板的混合物沉降至管底，将微量离心管重新置于冰上。

3.      在引物与模板的混合物中加入：

5 mmol/L dNTP 溶液           1 μ l

5 ×随机引物缓冲液           10 μ l

10 mCi/ml [ α -³² P] dNTP      5 μ l

（比活性 3000 Ci/mmol ）   

水                          加至 50 μ l

 

 

5 ×随机引物缓冲液：

 

250 mmol/L Tris (pH8.0)

 

25 mmol/L MgCl₂

 

100 mmol/L NaCl

 

10 mmol/L 二硫苏糖醇（ DTT ）

 

1 mol/L HEPES( 用 4mol/L NaOH 调至 pH6.6)

 

1 mol/L DTT 贮存于－ 20 ℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT

 

4.      加入 5 单位（约 1 μ l ）的 Klenow 片段，轻弹管壁以混合各组分。以最大速度离心 1 ～ 2s 使所有液体沉降到管底。反应混合物室温下反应 60min 。

5.      在反应液中加入 10 μ l NA 终止 / 贮存缓冲液，可根据需要进行以下步骤。

NA 终止 / 贮存缓冲液：

50 mmol/L Tris-Cl(pH7.5)

50 mmol/L NaCl

5 mmol/L EDTA(pH8.0)

0.5% (m/V) SDS

贮存放射性标记的探针于 -20 ℃以备杂交用。

或

通过离心柱层析分离放射性标记的探针与未结合的 dNTP 或以乙酸铵和乙醇选择性地沉淀放射性标记的 DNA 。如果＞ 50% 的放射性 dNTP 已在反应中掺入，可不进行该步骤。

 

 

另法

 

1 ． 1.5ml 微量离心管内依次加入：

10 ～ 200ng 模板 DNA （溶于 1 ～ 9 μ l 水）

灭菌双蒸水加至 9 μ l

2 ．离心管加热至 100 ℃ 5min 即置入冰浴，短暂离心。

3 ．冰浴上依次加入：

2 μ l 10 ×反应缓冲液

1 μ l 0.5 mmol/L dATP （终浓度 25 μ mol/L ）

1 μ l 0.5 mmol/L dGTP （终浓度 25 μ mol/L ）

1 μ l 0.5 mmol/L dTTP （终浓度 25 μ mol/L ）

5 μ l α－ [³² P] dCTP （终浓度 0.83 μ mol/L ）

1 μ l 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 大片段（ 2U ）

4 ． 37 ℃温育 30min 。

5 ．当温育反应物时，同时制备 Sephadex G-50 自旋转， 2000 × g 离心 2 min 。

6 ．加入 2 μ l 0.2mol/L EDTA （ pH8.0 ）终止反应。反应混合液装样至自旋柱， 2000 × g 离心 4min 。

7 ．取 1 μ l 柱洗脱液用液闪仪计数。用于杂交实验前，应将探针加热至 100 ℃ 5min 使之变性，随即置入冰浴 5min 。