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    方案10 定量蛋白质组学的体内蛋白质同位素标记实验

    相关实验：质谱在蛋白质组学中的应用实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    酿酒酵母
    丙酮 乙腈 NH4HCO3 细胞生长培养基 干冰 冰水 2-巯基乙醇 甲醇 铁氰化钾 蛋白提取试剂 组合蛋白酶抑制剂 硫代硫酸钠
    离心蒸发仪 离心管 血细胞计数器 孵育器 MALDI- TOF 质谱仪和 LC-MS MS 系统 超声波破碎仪 分光光度计

    步骤

    一、培养细胞

    ①在培养皿中挑选一个新长的单克隆，接 种 在 2ml 15N 标记的培养基上。另选 一个单克隆作为对照，接 种 在 2m l未标记的培养基中

    二、提取蛋白的细胞准备

    三、蛋白质提取

    向 冰 冻 的 细 胞 样 品 中 加 入 适 量 的 蛋 白 提 取 试 剂 （ 含 组 合 蛋 白 酶 抑 制 剂 和 10m m o l /L 2-巯基乙醇）。通 常 2.5〜5m l 提 取 试 剂 （ Y -P E R 试剂）可 用 于 Iml (Ig) 细胞样品。 ⑯ 室温缓摇温育30mi n。 ⑰ 离心沉淀碎片，收集上清。 ⑬ 加 入 5 倍体积的冰冻丙酮到上清中，涡旋振荡。 ⑲ 蛋白提取物一80° C 孵 育 IOmin。 ⑳ 4°C 、 20000g 离心 5m i n。 ㉑ 除去上清，迅速进行步骤⑫ ，或将沉淀的蛋白存于一 80°C 。

    四、蛋白质分离

    多种方法可供选择进行蛋白质分离，如 2D 凝 胶 、 H P L C 和 S D S -P A G E 以及 2D -H P L C 。在此可使用任何一种方法。 2D 凝胶电泳：下列步骤是2D 凝胶电泳的概要，具体步骤详见第4 章 。 a. 用再水化缓冲液A 400jul溶 解 500y g 蛋 白 质 样 品 （ 步骤㉑ ）。 b. 在固定化干胶条上水化上样。 c•进行第一向等电聚焦。 丄将胶条转移到聚丙烯酰胺凝胶（12. 5 % T ， 2. 7% 〇 , 进 行 S D S -P A G E 第 二向分离。 e. 电泳结束后，可 用 银 染 方 法 （ 该染色方法与随后的M S 检测相匹配）进
    行 染 色 （ 见第4 章方案12)。 f. 进行步骤⑬ 。. H P L C -S D S /P A G E : 以下步骤为离子交换H P L C 和一维电泳的概 要，详细内容分别参见第5 章和第2 章。 a. 在 2m l 水化缓冲液B 中溶解I O m g 蛋白质样品。 b. 将流速设为lml/m i n ，流动相B 的浓度梯度设为： 0〜5rriin 0 % B 5〜45min 0〜50% B 45〜60min 50% 〜100% B c•收集30份样品，每个组分2m l 。 d. 完 成 H P L C 后 ，每 个 组 分 （2m l ) 中加入Iml 100g/L 的 T C A 以沉淀蛋 白质。试管涡旋后冰浴30m i n 。 e. 室温 3000^■离心 30m i n 。 f. 除去上清，加 人 S D S -P A G E 样品缓冲液，对每个组分的蛋白质进行梯度 电泳分析（8 % 〜1 6 % 三甘氨酸梯度胶）。 g. 可用银染方法（ 该染色方法与随后的M S 检测相匹配）进 行 染 色 （ 见第2 章方法7)。 h. 进行步骤⑬ 。 2D -H P L C : 以下步骤为离子交换H P L C 和 R P -H P L C 的概要，详 细内容参见第5 章。 a. 用 2m l 水化缓冲液溶解I O m g 蛋 白 质 （ 步骤㉑ ）。 b. 将流速设为lml/m i n ，流动相B 的浓度梯度为： 0〜5min 0% B 5〜45min 0〜50% B 45〜60min 50% 〜100% B c. 收集30份组分，每份2m l 。 d•分别将每个组分（2m l ) 加到第二向H P L C 柱上，即反相柱。 用于洗脱的溶剂A : 5 % 乙腈，含 0.1% T F A ; 溶剂 B : 9 5 % 乙腈， 含 0. 1 % T F A 。 e. 流速设为lml/m i n ，流动相B 的浓度梯度为： 0〜5min 0% B 5〜60min 0〜55% B f. 收 集 30 份组分，每份2m l 。 g. 完成第二向H P L C 后 ，在离心干燥器中干燥样品。 h. 加20沁2〇111_1/乙： ^^4?10〇3和5111111〇1/1^正辛基葡萄糖苷，涡旋后超声 处理，检测 p H 应为约8. 5。 L 每份样品中加人1沁 （0.05〜ljUg) 的胰酶， 37° C 孵育过夜。 (加入胰酶的量取决于蛋白质浓度，最终溶液中底物：酶=50 : 1)。 j. 进行步骤⑭ 。

    五、胶内酶解

    ⑬ 用新鲜配制的15m m o l /L 铁氰化钾和50m m o l /L 硫代硫酸钠混合液将银染的 胶脱色几分钟。 ⑭ 以 500W 5 0 % 甲醇/ 4 0 % 水/ 1 0 % 乙酸溶液洗胶30m in ， 期间保持晃动。 ㉕ 重复步骤⑭ 4 次以上，每次使用新配的溶液。 ㉕ 将胶与500p l 5m m o l/L N H 4H C O 3 溶液孵育5m in 。 ⑫ 将胶与5〇〇沁乙腈孵育5m in 。 ⑳ 使胶在离心蒸发仪中完全干燥。 ㉙ 向干燥的胶块中加人2]^1 25m m o l/L N H 4 H C O 3 (含 0 . 05呢胰酶和0 . 1 % 正辛 基葡萄糖苷），使之吸胀。 ©待 所 有 溶 剂 进 入 胶 后 （ 通常5〜1〇111丨]| 1)，加入10^125111111〇1凡 1' ^ 41^〇 3 (含 0 .1%正辛基葡萄糖苷）， 37°C 条件下静置2h 。 ㉛ 用 4〇 4 乙腈/水/ T F A (66 : 33 : 0.1，体积比） 溶 液 在 3 5 0 W 超声仪中抽提 酶 解 肽 段 2 次 ，每 次 5〜 lO m in 。 ㉜ 将合并的抽提物（ 约 90jd) 于离心蒸发仪中抽干。

    六、蛋白质质谱分析

    用 5 4 乙腈/水/ T F A (5 : 95 : 0 •1，体积比）溶解抽干的经胰酶消化的肽段。 ⑭ 将 1 0 % 样品进行M A L D I -T O F -M S 分析，剩余的样品用于L C -M S /M S 分析。 通过2D -H P L C 分离并在溶液中消化的样品，在进行M A L D I 分析之前 必须用ZipTip脱盐，或在进行M S /M S 之前过R P - H P L C 柱。

    ​

    来源：丁香实验

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