方案8 通过肽的半胱氨酰化捕获蛋白质

一、变性、还原和缓冲液置换

1.在真空干燥器中浓缩 120 ug 混合蛋白样品，直至完全干燥。

2.将蛋白样品重新溶解在约 1ml 变性/还原缓冲液中，37°C 孵育 30 min，使样品变性还原。

体积不掃要非常精确，因为在下一步操作中缓冲液还需置换。不过样品体积越小，需要置换的时间就越短。

3.除去还原剂，降低尿素浓度以及除去缓冲液中的干扰成分。用约 4 ml 生物素化/胰酶消化缓冲液置换原液，在 Centricon YM-3 浓缩管中进行（4°C 离心）。

二、标记 Biotin-HPDP 和缓冲液置换

4.标记所有自由巯基。加入 50ul 4 mmol/L Biotin-HPDP(溶于 DMSO 中）到样品中（第③步操作后样品体积约为 1ml)，室温孵育标记混合物 90 min。

由于不确定标记反应是否能在 2mol/L 尿素存在的情况下有效进行, 所以可加人过量的 Biotin-HPDP。Biotin-HPDP 的量应大于亲和柱的结合能力（理论上，Img 抗生物素蛋白可结合 59nmol 的生物素）。

5.用新鲜的生物素/胰酶消化缓冲液置换原液，以除去未结合的 Biotin-HPDP。

置换在 CentriconYM-3 浓缩管中进行（4°C 离心）。

未结合的 Biotin-HPDP 会与生物素化的多肽竞争结合抗生物素蛋白。

第③步用过的 CentriconYM-3 浓缩管可在这一步重复使用。

三、标记后蛋白混合物的消化

6.加 1.5ug 胰酶到生物素化的样品中，孵育消化过夜（37°C)。

7.用 PBS(含 1mmol/L EDTA) 稀释样品消化产物，使尿素浓度降到0.5 mol/L 以下。

如果在几个小时内就用于抗生物素亲和柱，样品则可以在室温、4°C 或冰冻保存。若需要留存更长时间，则保存在-80°C。

四、固定化抗生物素亲和柱捕获及洗脱

8.用 5 ml PBS(含 lmmol/LEDTA) 平衡 1ml 固定化抗生物素亲和柱。

9.将消化后的样品（来自第⑦步）加到亲和柱上，封闭亲和柱，室温孵育 30 min。注意不要让柱子变干。

10.为收集不含半胱氨酸的多肽，用 10 ml PBS(含 1mmol/LEDTA) 淋洗柱子，并收集洗脱液。这样可获得穿透组分。

11.从固定化抗生物素亲和柱上洗脱含半胱氨酸的多肽。

（1）加 2 ml 含 50 mmol/LDTT(现用现加）的 PBS 到柱子上，使其进入柱子。

（2）封闭柱子，室温孵育 30 min。

（3）打开柱子，收集 2 ml 洗脱液，得到结合组分。

五、烷基化和除盐

12.如果要进行 LC-MS/MS 分析，需用 IAA(分别为 10 mmol/L 和 100 mmol/L) 对穿透组分和结合组分分别进行烷基化，避光室温作用 30 min。

13.用 90% 甲酸酸化肽段（分别加 20 沁到结合组分，IOOiLd 到穿透组分），使甲酸终浓度为 1%。在脱盐前一直将样品保存在-80°C。

14.根据厂商提供的使用说明，在 LC-MS/MS 之前用 Oasis HLB 抽提柱（或类似设备）对各个组分进行脱盐。