材料与仪器
可溶性蛋白组分
乙腈（5%) 0.5%乙酸 NH4HCO3(1mol L） CaCl2 色谱溶剂 二硫苏糖醇（DTT ） 内切蛋白酶Lys-C 碘乙酰胺（IAA） 修饰的胰酶 尿素
C18固相抽提移液头 纯金导线 高效液相色谱仪 Nano-LC 离子源 PEEK 微型四通 串联质谱仪 水浴锅
乙腈（5%) 0.5%乙酸 NH4HCO3(1mol L） CaCl2 色谱溶剂 二硫苏糖醇（DTT ） 内切蛋白酶Lys-C 碘乙酰胺（IAA） 修饰的胰酶 尿素
C18固相抽提移液头 纯金导线 高效液相色谱仪 Nano-LC 离子源 PEEK 微型四通 串联质谱仪 水浴锅
步骤
##一、用于MuDPlT 分析的可溶性蛋白提取物的消化
1.用 1 mol/L NH4HCO3将蛋白提取物的pH值调至8.5。测定蛋白质浓度（该浓度可作为参考，以确定在步骤⑤和步骤⑦所需要加人的蛋白酶量）。
2.向蛋白提取物中加入固体尿素，至终浓度为8mol/L。
3.向蛋白溶液中加入DTT至终浓度lmmol/L，50°C赙育20 min。
4.将已变性的蛋白溶液冷却至室温，加入碘乙酰胺至终浓度为10 mmol/L，室温避光孵育20 min。
5.加入内切蛋白酶Lys-C，使底物：酶的比例为100:1，于37℃衅育过夜。
6.用100 mmol/L(pH8.5)NH4 HC03稀释样品至尿素浓度为2mol/L, 加入CaCl2至终浓度为lmmol/L。
7.任选下面两种方法之一，将蛋白混合物进行胰酶消化。
###方法A:
（1）加人胰酶，至底物：胰酶为50:1，37°C孵育过夜。
（2）在微量离心管中以最髙速度离心，除去不溶性物质。
（3）转移上清至新的离心管中。
###方法B:
（1）每 50ug 蛋白样品中加人约 1ul Porosyzme-固定化胰酶，37°c孵育轻摇过夜。
（2）在微量离心管中以最高速度离心，除去不溶性物质。
（3）转移上清至新的离心管中。
方法B的优点是可减少蛋白样品中的胰酶污染，有利于后续分析。
8.参照使用说明书，将上清加到 SPEC Plus PT C18固相抽提柱上。将上清用5% 乙腈/0.5% 乙酸置换。
本步骤很重要，可除去多肽混合物缓冲液中与ESI-MS/MS不相容的盐成分（如NH4HCO3和尿素等）。从样品中除盐非常关键，因为盐可阻止多肽与2D柱中强离子交换树脂的结合，从而使多肽在未与离子交换树脂结合的情况下直接与反相填料结合，结果使 2D-LC 实际上成为一维反相柱。
通过人为控制，可使多肽中的盐从阳离子交换柱转移到反相介质中。含有 1mol/L 盐的样品无法进行 MuDPIT分析。另外，该抽提柱可用于浓缩样品，这同样重要，因为加入 15ul 的样品到 2D 微型层析柱上约需要 1.5 h。
##二、MuDPIT
1.用 1 mol/L NH4HCO3将蛋白提取物的pH值调至8.5。测定蛋白质浓度（该浓度可作为参考，以确定在步骤⑤和步骤⑦所需要加人的蛋白酶量）。
2.向蛋白提取物中加入固体尿素，至终浓度为8mol/L。
3.向蛋白溶液中加入DTT至终浓度lmmol/L，50°C赙育20 min。
4.将已变性的蛋白溶液冷却至室温，加入碘乙酰胺至终浓度为10 mmol/L，室温避光孵育20 min。
5.加入内切蛋白酶Lys-C，使底物：酶的比例为100:1，于37℃衅育过夜。
6.用100 mmol/L(pH8.5)NH4 HC03稀释样品至尿素浓度为2mol/L, 加入CaCl2至终浓度为lmmol/L。
7.任选下面两种方法之一，将蛋白混合物进行胰酶消化。
###方法A:
（1）加人胰酶，至底物：胰酶为50:1，37°C孵育过夜。
（2）在微量离心管中以最髙速度离心，除去不溶性物质。
（3）转移上清至新的离心管中。
###方法B:
（1）每 50ug 蛋白样品中加人约 1ul Porosyzme-固定化胰酶，37°c孵育轻摇过夜。
（2）在微量离心管中以最高速度离心，除去不溶性物质。
（3）转移上清至新的离心管中。
方法B的优点是可减少蛋白样品中的胰酶污染，有利于后续分析。
8.参照使用说明书，将上清加到 SPEC Plus PT C18固相抽提柱上。将上清用5% 乙腈/0.5% 乙酸置换。
本步骤很重要，可除去多肽混合物缓冲液中与ESI-MS/MS不相容的盐成分（如NH4HCO3和尿素等）。从样品中除盐非常关键，因为盐可阻止多肽与2D柱中强离子交换树脂的结合，从而使多肽在未与离子交换树脂结合的情况下直接与反相填料结合，结果使 2D-LC 实际上成为一维反相柱。
通过人为控制，可使多肽中的盐从阳离子交换柱转移到反相介质中。含有 1mol/L 盐的样品无法进行 MuDPIT分析。另外，该抽提柱可用于浓缩样品，这同样重要，因为加入 15ul 的样品到 2D 微型层析柱上约需要 1.5 h。
##二、MuDPIT
来源：丁香实验
