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    方案11 利用脱水胰酶亲和捕获蛋白质实验

    相关实验：质谱在蛋白质组学中的应用实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    乙酸 牛胰酶 CaCl2 溴化氰活化的 Sepharose 4B HCl KOH NaHCO3 NaOH PMSF PBS 硫酸鲑精蛋白 乙酸钠 三氟乙酸 Tris-Cl
    透析膜 烧结的玻璃漏斗 水浴锅

    步骤

    一、ST-Sepharose 亲和树脂的制备

    ©于75]1110.1111〇1/1^%?1〇33(9118.3)中溶解101^牛胰酶和2.58硫酸鲑精 蛋白， 37°C 孵 育 lOOmin。 ② 将 溶 液 l〇〇 °C 加 热 3m i n 以终止酶解，然后冷却至室温。 ③ 称 取 U .3g 溴化氰活化的Sepharose 4B 琼脂糖凝胶树脂。 ④ 将树脂置于烧结玻璃漏斗中，用 3L l m mol/L H C l 洗 涤 15m i n。 ⑤ 将步骤②所得的鲑精蛋白-胰蛋白酶与步骤④中的树脂混合，室温轻摇 l h，使 鲑精蛋白-胰蛋白酶结合到活化的琼脂糖上。 ⑥ 加 人 10倍体积的0. lmol/L N a H C 0 3 (p H 8. 3 ) 至琼脂糖悬浮液中以稀释多 余 的 配 体 （ 即鲑精蛋白-胰蛋白酶），以有利于接下来的去除步骤。 ⑦ 加 入 50m l 0. lm o l/L T ris-C l ( p H 8. 0 ，含 0. 5m o l/L N a C l) ，室 温 静 置 2h ， 以封闭剩余的活化基团。 ⑧ 吸去树脂上所有的剩余液体。 ⑨ 进行三轮交替p H 值的洗涤： 0. lm o l/L •乙酸钠（ p H 4. 0 ) ，含 0. 5m o l/L N aC l 0. l m o l /L T ris-C l (p H 8. 0 ) ，含 0. 5m o l/L N aC l 每次洗涤用50m l 溶液，且每次洗涤之间树脂需静置片刻，并吸出所有
    液体。 ⑩ 将 S T -Sepharose树脂保存于P B S (含 0 . 02% N a N 3 ) 中。 . ST-Sepharose 4°C 可 保 存 1 年以上，不影响亲和能力。 按以上方法一次可以处理一批S T -Sepharose树 脂 ，步骤⑥ 〜⑩可以在 一个柱子上进行。

    二、脱水胰酶的制备

    ⑪ 用 2.5ml P M S F (87. 5m g ，溶 于 丙 酮 中 ）钝 化 500m g 牛 胰 酶 （ 溶 于 250ml 0.05mol/LTris [p H 7.0]，含 20m m o l /L C a C l 2)，室温轻搅 30m i n ，用 0.02mol/L N a C l 调 p H ，并 用 p H 计 监 测 整 个 过 程 的 p H 值 ， p H 应 保 持 在 7.0 (Ishii， etal， 1983)。 ⑫ 终 止 反 应 ，加 lmol/L H C l 至 p H 为 3.0。 ⑬ 以 15L lmm o l / L H C l 对 胰 酶 于 4°C 透 析 过 夜 ，透析膜 的 截 留 分 子 质 量 为 6000〜8〇0〇 D a o ⑭ 透 析 后 的 经 P M S F 钝化的胰酶的体积约为290m l , 用 lmol/L K O H 调 p H 至 碱 性 （ 大约需要1/19体积的1111〇1/1^仄011，约15.31111)。 0°〇下搅拌2〇111111。 ⑮ 然 后 用 约 15. 6m l 的 lmol/L 乙酸 调 节 p H 至 5. 0 ，再 加 入 6. 4m l 的 lmol/L CaCl2 至溶液中。 最终溶液中应含50m m o l /L 乙酸和20m m o l / L C a d ⑯ 用 0. 22/x m 的过滤器过滤P M S F 钝 化 的 胰 酶 液 （327ml)。 ⑫ 按以下方法在 S T -S e p h a r o s e柱上纯化脱水胰酶 （Kasai and Ishii， 1975): a. 制 备 S T -S e p h a r o se 柱 。用 5 0 m m o l/L 乙 酸 钠 （p H 5 . 0 ， 含 0 . 0 2 m o l/L CaCl2) 冲洗介质，以去除N a N 3, 并平衡柱子。 b. 以 lml/m i n 的流速向柱中加人P M S F 钝化的胰酶溶液。 c• 用 1 5 倍 体 积 的 50m m o l / L 的 乙 酸 钠 （p H 5. 0 ，含 0. 02mol/L CaCl2) 溶液洗柱，流 速 3ml/m i n。 d. 用 3 倍柱床体积的5m m o l / L H C l 洗脱脱水胰酶，流 速 为 lml/m i n， 用分光光度计在A 28q 监测洗脱峰。

    三、脱水胰酶亲和柱的制备

    ⑬ 取 I O m l 浓 缩 脱 水 胰 酶 液 ，用 等 体 积 的 〇.l m 〇 l/L N a H C O 3 ( p H 8.3，含 0. 5mol/L N a C l ) 溶液稀释。 以下偶联方法是基于A x e n 和 E m b a c k ( 1 9 7 1 ) 的改进技术。 ⑲ 往 稀 释 的 胰 酶 中 加 入 lmol/L 的 N a H C O 3 (p H 8. 3 ，含 5mol/L N a C l ) 溶液 l m l，然 后 用 0. 22|u m 过滤器过滤。 溶液的终浓度为 〇. lmol/L N a H C 〇 3 (p H 8. 3)，含 5mol/L NaCl。过 滤可除去沉淀，以防阻塞层析柱。 ⑳ 取 l m m o l/L 的 H C l 溶 液 7〇 m l ，洗 涤 0. 3M g 溴 化 氰 活 化 的 Sepharose 4B 树脂。 ㉑ 将溴化氰活化SepharoseAB树脂和稀释的脱水胰酶混合，室温轻摇3h 。
    根据使用说明，用亲和树脂填充层析柱。 ⑬ 用 5 倍柱床体积的0 •lmol/L N a H C O 3 (p H 8. 3 ，含 0. 5mol/L NaCl) 洗去介 质上多余的配体。 ■ ⑭ 用 10 倍体积的 0. lm o l/L T ris-C l (p H 8. O，.含 0. 5m o l/L N a C l) 封闭介质上 的任何游离活性基团。 ㉕ 室温条件下进行3 轮 交 替 p H 的洗涤，每 次 用 20m l 溶液，每 次 约 5m i n : 0. lm o l/L 乙 酸 钠 （ p H 4.0)，含 0.5m o l/L N aC l 0. lm o l/L T ris -Cl (p H 8. 0 ) , 含 0. 5m o l/L N aC l @ 将脱水胰酶-S e p h a ro s e 亲和柱保存在含0. 02N aN 3 的 P B S 中 。 脱水胰酶-s e p h a r o s e 可 在 4 °C保存一年以上.

    四、样品制备、加样和洗脱

    在加样之前，先 用 〇. l m o l / L 的乙酸使蛋白样品酸化（ p H 5.0)。 @ 每次上样2ml (该亲和柱的最大装样容量是2m l)。 可用脑啡肽-精氨酸的标准样品测定亲和柱的容量。所加样品的量不 能 超 过 亲 和 柱 的 最 大 容 量 。亲 和 柱 用 50m m o l /L 的 乙 酸 钠 （ P H 5.0)/ 20m m o l / L C a C b /O.〇2%N a N 3 平衡和冲洗。 ⑳ 用 0.05% (体积分数） T F A 从脱水胰酶亲和柱上洗脱多肽。 其 他 洗 脱 方 法 ：以 5m m o l / L HCl 或 O.lmol/L 甲 酸 （ Kumazaki，et al， 1卯7) 洗 脱 ，或 进 行 P H 5 . 0 至 p H 2. 5 的 梯 度 洗 脱 （ Kumazaki， etal， 1986)0

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    来源：丁香实验

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