反相高效液相色谱

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

RP-HPLC 越来越多地应用于蛋白质的分离，主要包括分析型和制备型。但如果要求纯化过的蛋白能够恢复活性并重新折叠为正确的三维结构，则不建议使用 RP-HPLC，因为许多蛋白在有机溶液中会发生不可逆变性。反相支持物（骨架）上的蛋白分析也会碰到低的回收率、畸形峰、「鬼峰（ghosting)」（即某个蛋白峰在进行下次色谱分析时虚假地再次出现）等问题。

[澳] 理查德 J. 辛普森 (Richard J.Simpson) 主编何大澄主译

来源：丁香实验

操作方法

方案1 蛋白质 RP-HPLC 的标准色谱条件

1.进行空白或对照层析谱分析（即在步骤①中不加样）。一般这是进行一天层析工作的开始。下面是推荐使用的用于 RP-HPLC 系统评估的标准色谱条件。（1）线性梯度：从 0~100% 的溶剂 B，溶剂 A 是 0.1% 的 TFA 水溶液 (体积分数），溶剂 B 是含 0.09%TFA 的 60% 乙腈水溶液；（2）梯度率：1%B/min(即 60 min 内溶剂 B 从

方案2 填充 RP-HPLC 毛细管微柱

一、毛细管液相色谱系统的构造下面所用的溶剂传送系统（见图 5.10，AHewlett-Packard HP1090M 液相色谱仪）被用作「辅助（slave)」泵来形成微梯度。二、流体的形成 1.为使通过毛细管柱的流速精确到0.05~20ul/min，并能形成可重复的梯度，可以安装一个预加样分流器（l/16in[1.59 mm] 的 T 形管），引导 95% 以

方案3 不易分离的大分子量多肽的纯化实验

一、用于 RP-HPLC 纯化的大分子非极性多肽或蛋白质样品的制备 1.将多肽样品（如果蛋白质是通过固相化学合成法得到的，质量在 30~50 mg 之间，尽管其量低至 mg 级，方法与其他来源的蛋白相似）在微量离心管中用洗脱液溶解（使用溶液 B，如果样品在 30~50 mg 之间，则应用 1ml 溶液 B 来溶解；如样品量更少，则相应减少溶液 B 的用量）。根据多肽或蛋

方案4 用 RP-HPLC 对固相合成的多肽进行纯化实验

一、流动相的配制 1.分别配制 1L 的洗脱液 A(弱流动相）和洗脱液 B(强流动相）。例如：洗脱液 A 为 0.1%TFA 水溶液洗脱液 B 为含 0.09%TFA 的 60% 乙腈水溶液要点：用于蛋白质测序的 TFA，因其含有抗氧化剂而不适用于 RPHPLC 样品的洗脱。有机溶剂和水必须分别用两个量筒来测量，然后再混匀，因为混合时体积将会减小，最

方案5 用 RP-HPLC 技术对多肽和蛋白质混合物进行脱盐实验

一、流动相的配制 1.配制缓冲液 A(弱流动相）和缓冲液 B(强流动相）各 1L，例如：缓冲液 A:0.1%TFA 水溶液。缓冲液 B:0.09%TFA 的 2-丙醇溶液。要点：用于蛋白质测序的 TFA，因其含有抗氧化剂而不适用于 RPHPLC 样品的洗脱。 2.在备好的量筒中用 Teflon 包被的磁转子将溶液搅拌均勻（时间视体

方案6 计算机辅助方法优化梯度条件的 RP-HPLC 蛋白质分离实验

一、配制流动相以下因素与用于洗脱含有肽及蛋白质的样品的流动相的制备有关。 1.配制各 1L 的洗脱液 A(弱流动相）和洗脱液 B(强流动相）。例如：洗脱液 A:0.1%TFA 水溶液洗脱液 B: 含 0.09%TFA 的 60% 乙腈水溶液（体积分数）有机溶剂和水必须分别用两个量筒来量，然后再混匀，因为混合时体积将会减小，最多每升可减少 3