方案2 填充 RP-HPLC 毛细管微柱

一、毛细管液相色谱系统的构造

下面所用的溶剂传送系统（见图 5.10，AHewlett-Packard HP1090M 液相色谱仪）被用作「辅助（slave)」泵来形成微梯度。

二、流体的形成

1.为使通过毛细管柱的流速精确到0.05~20ul/min，并能形成可重复的梯度，可以安装一个预加样分流器（l/16in[1.59 mm] 的 T 形管），引导 95% 以上的溶液通过一个长约为 1OOcm(内径 0.1OmmX 外径 0.26 mm) 的溶合桂胶管流人废液池。

2.直接将毛细管柱连接到带有0.2~1.Oul 内置样品转子的 Rheodyne7520 型加样器或装有0.5~50ul 加样环的 8125 型加样器上。

3.将层析柱的流速精确设置到 0.4~4ul/min 可通过调节熔合硅胶管到废液池的长度或改变栗的流速（100~500ul/min) 来完成。

对于这种分流的方法，定期（如每天）监控层析柱的实际流速是很重要的。可以通过在出口处安装一个 10ul 的色谱注射器，对层析柱中液体的弯月面的推进进行精确计时。有关该系统构造中所提到的各种部件及其供货商的详细情况在「2.1 材料」中列出。

三、UV 检测器

1.采用 ThemoGalactic/SpectraPhysics 正向光学扫描检测器，以 214nm 吸收值来检测毛细管 HPLC 系统的洗脱情况，该检测器装有一 U 形纵向毛细管流动池（路径长度 6 mm，容积约 26.5 ml)。

2.Spectra Focus 软件传输到个人电脑上，或者同时用多波长模式（195~340 mm，5 mm 间隔）来记录。

3.对于毛细管液相色谱/质谱仪（LC/MS) 联用，用一根 50 cm 长的熔合硅管 (内径 0.05 mm X 外径 0.19 mm) 将 UV 检测器直接与电喷雾入口连接起来。

该管替代了标准不锈钢电喷雾针，可一直延伸到喷射针的顶端。

4.对于纳流（nanoflow) 毛细管 HPLC, 纳流端直接与出口相连。

四、毛细管柱的构造

大量的文献已介绍了构成微柱的多种物质，如 Teflon 管（Ishii，etal，1977)、玻璃不锈钢（Chervet，et al，1989) 以及有聚酰亚胺外壳的溶合桂管（Yang,1982)。我们一般采用后者来制备微柱。与上面所提到的其他材料相比，具有聚酰亚胺外壳的熔合硅管具有许多显著的优点（见表 5.8)，如具有灵活性、易于处理和可通透性，且有商品化的各种不同内径和外径的型号，其价格相对低廉。

下面以 250 mmX0.20 mm 内径的层析柱为例，分步介绍0.1~0.32 mm 内径熔合硅微柱的组装过程。

1.切两段不同长度的聚酰亚胺熔合硅管，其中一段长为 250 mm(内径 0.200 mm，外径0.340 mm) 作为柱体，另一段长为 20.0 mm(内径 0.050 mm X 外径 0.190 mm) 作为层析柱的出口管。

注意：在填充层析柱的过程中，要戴防护眼镜，并遵循推荐使用的安全程序。

（1）用悬浆填充法将色谱支持物填充到薄壁毛细管的过程中，毛细管因受到高压（约 40MPa) 而易于折断。例如，在本实验中，内径0.32 mmX 外径 0.540 mm 和内径 0.200 mmX 外径 0.340 mm 的熔合硅管可耐受高达 45MPa 的局压，而内径 0.320 mmX 外径 0?450 mm 的管子在同样的压力下却容易折断，其填充压不得超过 5MPa。最后，还必须注意使用厚壁的熔、合硅管，因其可以以较高的压力填充，从而能够使层析柱获得良好的工作效率。

（2）为避免毛细管末端参差不齐，可以用蓝宝石刀来代替较为普通的玻璃刀。末端参差不齐的管子将会导致玻璃料定位不精确。

（3）用 Teflon 管来连接熔合硅管（见图 5.10)。由于来自不同厂家的熔合硅管的外径有细微的差别，通常加固这些接头以达到紧密连接。一般可以方便地采用两个钳子来夹紧内径稍大的 Teflon 管。

2.用一较短（50 mm) 的溶合桂管（内径 0.32 mm 或 0.20 mmX 外径 0.45 mm 或 0.34 mm) 作为圆盘切割器，从一大张 PVDF 膜上切下 PVDF 封管膜片，即通过将 PVDF 膜置于硅胶隔膜上，然后在 PVDF 膜上打孔而制成 PVDF 封管膜片。一般用柱的出口管将 PVDF 封管膜片插入到微柱中，约 1Omm 深。

另外，有很多有孔膜物质可用作微柱的封管膜片，包括 Zitex 膜（Davis 和 Lee，1 卯 2)、玻璃纤维滤纸（Davis 和 Lee，1992)、亲水性的聚偏二氟乙稀（PVDF) 膜（Moritz 和 Simpson,1992a，1992b)。在本实验中，采用了 0.45um 的多孔性亲水 PVDF 膜。

3.永久固定微柱体和微柱出口管：在两管接头处滴一小滴预处理过的环氧树脂。

环氧树脂已部分聚合或用加热枪处理使其塑化，以增加其黏度，因此不会渗人毛细管造成阻塞。

五、层析柱的填充

当将 PVDF 封管膜片固定好，熔合硅毛细管柱制备完成，便可以开始用悬浆填充法的程序来填充微柱。

1.用带有标准的内置液相色谱柱（0.5 mm 内径的流通孔以及 l/4in(0.635 cm) 柱末端接口）的中空 50 mmX2 mm 内径的玻璃衬里不镑钢管制备一个悬浆槽。

2.用 vespel 材料/石墨和手拧螺母将熔合硅微柱与标准的 1/4111 液相色谱末端接口连接起来。

3.在 I.5 ml 聚丙婦管中将反相桂胶浆在 n—丙醇（Aomg/zoojul) 中超声处理 15 min。

4.在填充层析柱之前，先按标准色谱柱填充法，用填充溶剂（n_丙醇）在高压下（40MPa) 填充毛细管柱。

这一步使用填充溶剂预填充微柱，可检测系统的密封性。

5.从层析柱填充机和微柱上将悬桨槽卸下，倒空，再复位，装入备好的 150ul 的反相硅胶浆混合物。

6.在恒压 40MPa 下，装柱 20 min; 在相同压力下再用 50% 甲醇溶液固定 20 min，然后就可以给层析柱减压了。

7.小心地拆下层析柱，将其顶端和底端都插入硅胶隔膜中，以使之密封。