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wb细节问题求解?。?
balalaLy
可以两个一抗一起孵,或者先孵25的那个,再孵actin,最后孵两个二抗的混合液。不过,如果25那个蛋白表达低的话建议先孵这个,显影完之后再孵actin,以免actin条带太亮影响目的蛋白。上样量一般上20ug的蛋白量。
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问
从细菌内提取蛋白做wb实验,常用的内参是什么?
loveliufudan
在从细菌中提取蛋白进行Western blot实验时,常用的内参有两种:原核生物中的通用蛋白:在细菌中表达量较为稳定且广泛分布的蛋白,如GroEL、DnaK等,通常作为内参来校正不同实验条件下的蛋白质表达量变化。特定蛋白:如果实验中需要检测的蛋白与某个特定蛋白有相关性,例如同属于同一个代谢通路或同一功能模块,则可以选择该蛋白作为内参来校正不同样品之间的蛋白质表达量变化。
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问
我想问一下我做IP-ms后并没有检测到目标抗体蛋白,后面又做了IP-WB验证结果也是符合质谱的结果,这个是否能说明抗体有问题或者
赛默飞世尔科技
如果整个实验的操作步骤和实验设计没有问题的情况下,IP-MS和IP-WB结果都没有靶蛋白,说明目标蛋白表达量很低。但首先需要排除一下,IP过程中是否存在抗原结合水平低,抗原洗脱水平低等因素的影响。
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问
请问在Co-IP结果中,阴参也能IP下来是什么原因?已经增加了洗涤的次数,但是洗涤是颠倒混匀的。
毛利小五郎的徒弟
考虑是阴参受到了蛋白污染,或者抗体与某些组分非特异性结合产生了ip条带
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问
在我做COIP时,经常会出现IP组蛋白表达甚至超过了INPUT组,是什么原因?
毛利小五郎的徒弟
考虑是抗体特异度差,没有特异性检测到目的蛋白导致的
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问
IgG也有目的条带,但是比实验组的IP样品弱,怎么办
毛利小五郎的徒弟
igG条带弱可能是由于裂解液中的去垢剂浓度太高或配方过于剧烈、蛋白与蛋白之间的相互作用太弱或不太稳定等原因导致。相应的举措有:1、降低去垢剂浓度或更换去垢剂种类;2、受蛋白的亚细胞定位影响,则新选择裂解液配方来释放目的蛋白;3、选择亲和力更高的抗体以捕获更多的目的蛋白,从而捕获更多的相互作用蛋白;4、选择目的蛋白或相互作用蛋白含量高的样品进行免疫共沉淀实验。
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问
我想问下为什么我跑的input,Ip,IGg都有条带
赛默飞世尔科技
input和IP泳道条带可以根据分子量来判断一下是否为目的蛋白,igg泳道通常是会在25kd,50kd出现抗体轻重链干扰条带
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问
免疫共沉淀IP样品,洗不干净怎么办,
毛利小五郎的徒弟
可以用甘氨酸洗脱:甘氨酸洗脱1. 用10 mM的Tris-Cl缓冲液把Beads洗3次,3,000 g速度离心5 min,尽量吸尽洗涤液;2. 加入洗脱缓冲液(0.2 M Glycine, 0.15% NP40,pH 2.3),一般50 µL的beads 需加入75-100 µL洗脱buffer;3. 室温震荡洗脱 10 min;4. 2000 g离心2 min,吸取上清到新的EP管中;5. 重复
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问
洗涤液用TBS就可以吗,很多文献用什么NETN buffer
赛默飞世尔科技
不同的蛋白互做,其结合力是不同的。所以洗涤液不是通用的。常用PBS或TBS,如果出现非特异性条带,可以增加NaC l浓度,降低由离子静电引起的相互作用。或是加入低浓度的还原剂,打开由二硫键或亲和作用引起的结合。针对不同的样品,需要通过实验对洗脱液的成分进行优化。
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问
Flag beasds 拉下来的flag条带有拖尾现象怎么解决
赛默飞世尔科技
Flag条带有严重的拖尾现象,可能是蛋白发生了降解。每次操作好样品后快速至于冰上,离心保持4度。同时可以加一些蛋白酶抑制剂。
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问
Co-ip ,如何避免下拉抗体的污染
赛默飞世尔科技
免疫沉淀复合物是三部分组成的,Protein A(G)凝胶,抗体IgG分子,目标蛋白。SDS-PAGE后,这些成分都会一起转移到膜上。当检测抗体与捕获抗体物种来源相同的时候,二抗会识别捕获抗体的重链轻链分子,导致出现55kDa重链带,20-25kDa轻链带的干扰。避免这些杂信号的影响呢?常见的方法有捕获抗体、检测抗体采用不同来源物种,使用针对检测抗体物种的特异性二抗;如果有可能,捕获抗体采用没有恒
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问
某个基因已经敲除了,理论上蛋白没有表达,为什么还能拉下来蛋白
毛利小五郎的徒弟
可能是抗体特异度差,将杂质的结合误认为目的蛋白
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试剂盒去除不掉55的重链(频率很高)该如何解决
毛利小五郎的徒弟
可以在IP和WB实验中使用相同的抗体,如果目的条带在55kDa左右,可以通过选择与轻链特异性结合的二抗,来消除重链条带对目的蛋白检测的干扰。
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问
我跑出来的Co-IP,为什么IgG有很浓的条带
毛利小五郎的徒弟
igG条带很浓可能是样品被蛋白酶降解导致的,建议添加蛋白酶抑制剂,且所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融。
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问
我做了几轮gst pulldown 拉不出来蛋白。可能有哪些原因呀
毛利小五郎的徒弟
1.选取的细胞中互作蛋白表达量很低;2.样品中含有的非特异蛋白过多3.样品中没有相互作用的蛋白质;4.样品中蛋白质浓度过低,肉眼难以观测到差异条带;
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问
igg组拉不出诱饵蛋白但能拉出捕获蛋白是怎么回事呀 igg和ab组都能拉出来诱饵蛋白
loveliufudan
如果在 Co-IP 实验中,IgG 组无法拉出诱饵蛋白,但能拉出捕获蛋白,可能有以下几种可能的原因:抗体的特异性问题:IgG 组中的抗体可能不够特异性,容易发生非特异性结合,因此无法富集诱饵蛋白。可以尝试使用更特异性的抗体或优化抗体浓度。Co-IP 条件的优化问题:Co-IP 实验中的洗涤条件非常重要,如果洗涤条件不足以去除非特异性结合的蛋白,就可能影响诱饵蛋白的富集效率。可以尝试增加洗涤次数、延
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请问26147试剂盒为什么洗不掉重链呀?频率还比较高
毛利小五郎的徒弟
重链洗不掉可能是交联作用太强了,可以加用裂解液增强洗脱
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问
关于用只识别天然蛋白的二抗,去除轻重链。洗脱下来的IP抗体是变性的,为什么目标蛋白不是变性的?
毛利小五郎的徒弟
大概率是因为环境不同,如ph,温度的差异导致ip抗体变性。
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问
请问跑胶上样可以直接带着珠子跑吗?
dxy_gxbqts1q
请问磁珠偶联的核酸链可以直接跑电泳吗
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问
用于Co-IP的适宜蛋白浓度和含量有推荐吗
毛利小五郎的徒弟
蛋白浓度一般在2-5ug/ul,每次5-10ul
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