wb细节问题求解？。？

电压一般209-300v，电流控制在59mA以下就可以，时间设置60-90分钟，上样量30-50ul

可以两个一抗一起孵，或者先孵25的那个，再孵actin，最后孵两个二抗的混合液。不过，如果25那个蛋白表达低的话建议先孵这个，显影完之后再孵actin，以免actin条带太亮影响目的蛋白。

上样量一般上20ug的蛋白量。

可以使用actin作为内参来进行蛋白质检测，不过需要注意actin的表达量应该与目的蛋白表达量相近，以确保内参的准确性。

对于不剪膜的蛋白质检测，一般的孵育方法如下：

将膜与孵育缓冲液（例如TBST或PBS）一起放入孵育盒中。

加入第一抗体和第二抗体的混合液（通常是1:1000或1:5000浓度），使其覆盖整个膜。

在4°C的条件下静置过夜，或者在室温下孵育1-2小时。

用缓冲液洗涤膜，以去除未结合的抗体。

加入荧光素底物或染色剂，进行可视化检测。

对于电泳条件的设置，25 kDa大小的蛋白一般使用200-300V的电压，30-60分钟的时间进行电泳分离。电流大小可以根据电泳仪的不同而异，通常在20-30 mA之间。

蛋白质浓度1.241mg/ml的话，可以根据实验需要来决定每个孔加多少样本。一般建议在10-30 μg之间，视实验需要而定。