Akt的WB问题

最近做Akt的WB遇到了问题：
我用的是CST的Akt抗体以及pAkt抗体，染小鼠组织（肝，肾，脾，肺，脑等）。
5%BSA（TBST稀释）4度封闭过夜
之后一抗是5%脱脂牛奶稀释，1：500，过夜，二抗1：2000稀释，2-3h
染出来的片子很脏，而且Akt勉强可以见到，但是pAkt没染出来条带
提组织用的是RIPA（每100mg用500ul），加了PMSF以及NaF，冰上操作，裂解1h，4度离心30min，取上清。
各位砖家有没有用CST抗体的，指点一二，小弟万分感谢！

CST的抗体用的多去了
总体来说akt的抗体还行
pakt用过两个效果不是特别好

蛋白提取的时候没有加其它的磷酸酶抑制剂？
一抗与二抗稀释的时候用5% BSA-TBST
一抗1:500是不是有点高了？
怎么没有试试1:1000？1:2000？
另外二抗稀释度需要调整，可以减低背景
ECL用那个公司的？

楼上正解。

个人建议：
1）裂解RIPA中加入磷酸化酶抑制剂；
2）CST的p-AKT刚好用过，建议用1：1000，二抗1：5000；
3）裂解时每15分钟混匀一次，裂解1h；
4）注意发光液有无过期；如有条件，可参考我发过的一个关于现配发光液的帖子；
5）我的经验是，上样30-50g蛋白时，曝光时间p-AKT需要15分钟（参照Actin 3秒钟）；
6）可考虑根据说明书取阳性对照样本上样，我们是用小鼠肝癌组织蛋白。

祝好运！

谢谢各位！
磷酸酶抑制剂只加了NaF，没加别的。
ECL用的是Pierce的，应该没有过期，因为染别的没问题
楼上说的上样应该是30-50ug吧~~~
我再根据你们说的试试看，有结果回来汇报~~~

最好是按照CST的protocol来做，比如封闭用5%牛奶（而非5%BSA,尤其是对pAKT 而言，效果更好）in TBST 室温一个小时，一抗稀释在5%BSA in TBST 中（而非5%脱脂牛奶）4度过夜，这样我相信背景会降低，提高信噪比。

补充一些,

理论上, 用WB测蛋白的磷酸化的时候,常规是BSA比牛奶更好. 因为牛奶中含有casein, 会非特异性的和测磷酸化的抗体结合,导致背景着色提高.AKT的磷酸化,我自己也用过BSA 也用过脱脂奶粉.感觉没多大区别.

磷酸化如果测不出来的时候

1. 可能是这个组织或细胞本身的磷酸化很低. 但是你用的那几个脏器,比如肝肺 都能测出来的.像前面几位战友说的那样,可以考虑加大上样量

2. 是否WB的条件不好? 可以跑其他蛋白的WB看看,如果其他蛋白质都跑出来的很好的话, 可以考虑换个抗体试一试,,但是话说回来,cell signaling的p-AKT 很好的,我也用了好几年.ser473和T308都不错的.

3. 条带弱的话,可以用 can get sinal 去提高抗体的敏感度.

BTW, 我自己跑p-akt的时候, 1抗是1:1500 2抗是 1:20000

good luck

我看好多文章都是通过提取组织来做wb 而我要做的是细胞 是否好做？因为时间紧所以想随便问一下 Akt 及p-AKT的wb是否好做？

二抗孵育时间太长，会把一抗洗掉。应缩减至1小时。
我的PAKT信号总是很强。有时不得不只上样1ug，一抗和二抗孵育时间有时只能缩减至10分钟。

http://www.dxy.cn/bbs/thread/21961528#21961528

http://www.dxy.cn/bbs/topic/24176732

PMID: 23195959