p-p38的Wb问题

大家好，本人最近一直在做p-p38的磷酸化，但是一直都做不好。希望各位大侠帮助解决：
蛋白上样量80-100ug，半干转膜70min，5%BSA封闭70min，一抗CST（#9211） 1：500加，4℃孵育过夜，二抗1:8000加室温70min。曝光出的结果很不好，杂带很多，也分析不出那条是目的条带，且没有趋势，见下图

1、上样量80-100太大了，但条带出来很浅，是不是定量有问题或者抗体有问题

2、背景太高，增加封闭时间和洗膜次数

3、杂带很多，抗体特异性不高

我最近做过CST的p-p38，1：800稀释，效果不错。5%牛奶封闭90min，抗体孵育过夜。

http://immunotech.dxy.cn/bbs/topic/11443307?ppg=24
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