一些有关p-ERK WB的问题

fangweibin119 wrote:
蛋白定量后上样量一致吗？
内参做了没有？

thinku_lo wrote:
一你可以搜索本版内有关p-ERK WB的相关帖子，相信你会找到不少可以提高阳性率的注意事项；

二是我没有用过hela系细胞株。但如果你找得到SW480(结肠癌)细胞株，是一个非常好的阳性对照，一秒钟曝光，条带强得一塌糊涂.......

祝好运！

bigrabbit wrote:
不知道你是如何处理细胞的，也不知道你所谓的阳性对照是什么意思。
一般来说，检测磷酸化蛋白时需要对细胞进行去血清处理，消除细胞的本底磷酸化水平。你所用的229可能本身的ERK磷酸化就很高，因此你处理后不一定能看出效果来，而293和因为正常情况下ERK磷酸化水平不高，自然处理后磷酸化就变化较明显。

建议：先用无血清培养基培养细胞过夜，然后进行你所需要的处理，注意处理时仍不能用血清，否则出来的信号可能只是由血清所激活的。

bigrabbit wrote:
不知道你是如何处理细胞的，也不知道你所谓的阳性对照是什么意思。
一般来说，检测磷酸化蛋白时需要对细胞进行去血清处理，消除细胞的本底磷酸化水平。你所用的229可能本身的ERK磷酸化就很高，因此你处理后不一定能看出效果来，而293和因为正常情况下ERK磷酸化水平不高，自然处理后磷酸化就变化较明显。

建议：先用无血清培养基培养细胞过夜，然后进行你所需要的处理，注意处理时仍不能用血清，否则出来的信号可能只是由血清所激活的。

bigrabbit wrote:
磷酸化与去过程一般来说是一个非常迅速的过程，通常在几分钟至几十分钟内就完成了。可能是我孤陋寡闻了，我觉得检测时间能由几分钟至2-3小时已经足够了。当然如果你的实验一定要观察至24小时，无血清饥饿就不合适了。

如果你的目的是要看一下细胞对刺激的反应，建议你先观察一下短时间的反应，比如无血清处理后，收集5min，15min，30min，60min，2hr，4hr的蛋白，这是文献中常用的方法，我没有找到有文献报道需观察24小时的。