【求助】p85和p-ERK western检测问题
丁香园论坛
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最近在做一个信号通路的下游磷酸化水平检测，但是做western没有看到任何条带,包括p-ERK,p85。麻烦各位战友帮我分析一下可能原因吧：
1.293T细胞转染质粒（带外源基因），24h
2.无血清培养18h
3.配体（外源基因是该配体的膜受体）激活，37度，10min
4.PLB（promega公司）裂解细胞，做western，抗体是SANTA CRUZ公司的p-ERK (Tyr 204)，以及cell signaling公司的Phospho-PI3K p85 (Tyr458)/p55(Tyr199)
我自己分析没有条带无非是细胞状态不好，或者抗体不好，不知道还有没有可能是没有加磷酸化酶抑制剂，以至于磷酸化的蛋白被去磷酸化了？
谢谢啦～
1.293T细胞转染质粒（带外源基因），24h
2.无血清培养18h
3.配体（外源基因是该配体的膜受体）激活，37度，10min
4.PLB（promega公司）裂解细胞，做western，抗体是SANTA CRUZ公司的p-ERK (Tyr 204)，以及cell signaling公司的Phospho-PI3K p85 (Tyr458)/p55(Tyr199)
我自己分析没有条带无非是细胞状态不好，或者抗体不好，不知道还有没有可能是没有加磷酸化酶抑制剂，以至于磷酸化的蛋白被去磷酸化了？
谢谢啦～
检测内参蛋白如GAPDH,ACTIN,TUBULIN是否成功？
用PLB裂解细胞得到的蛋白适合做REPORTER，做WESTERN不太合适。建议可以用其他BUFFER裂解蛋白。
检测蛋白磷酸化一定要加磷酸酶抑制剂！！除此以外还应该加蛋白酶抑制剂。
http://www.millipore.com/techpublications/tech1/mcproto402
Protease Inhibitors
· EDTA: 1 mM
· PMSF: 1 mM
· Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 µg/ml each
Phosphatase Inhibitors
· Na3VO4: 1 mM
· NaF: 1 mM
有钱可以直接买INHIBITORS COCKTAIL。许多公司有买。
用PLB裂解细胞得到的蛋白适合做REPORTER，做WESTERN不太合适。建议可以用其他BUFFER裂解蛋白。
检测蛋白磷酸化一定要加磷酸酶抑制剂！！除此以外还应该加蛋白酶抑制剂。
http://www.millipore.com/techpublications/tech1/mcproto402
Protease Inhibitors
· EDTA: 1 mM
· PMSF: 1 mM
· Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 µg/ml each
Phosphatase Inhibitors
· Na3VO4: 1 mM
· NaF: 1 mM
有钱可以直接买INHIBITORS COCKTAIL。许多公司有买。
嗯，谢谢yhwangcams，按照你说的方法试一下～
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