western blot 问题条带的原因？附解决办法

蛋白样品、抗体

（1）杂交信号很弱，条带浅，如下图

原因及对策：

1. 蛋白量太少，可以适当增加蛋白上样量；

2. 抗体效价太低，可以适当加大抗体浓度；

3. 过度漂洗膜，也可能会导致信号变弱、条带太浅；

4. 转移到膜上的蛋白太少，当蛋白分子量 <10 KD 时，可减少转膜时间、使用小孔径的膜或配置厚度适当的凝胶。

（2）条带上有单个或多个白点

原因及对策：「三明治」结构不紧凑导致，夹板做「三明治」结构时要确保膜和胶块之间没有气泡。

（3）出现「微笑」或「倒微笑」条带

原因及对策：

1. 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓；

2. 分离胶凝固时可用 1 mL 无水乙醇覆盖分离胶液面，阻断空气，分隔线会更加平直，也会减少“微笑”或“倒微笑”条带的出现；

3. 胶板底部有气泡会影响电泳效果，开始电泳前应倾斜电泳装置，赶走气泡。

（4）出现非特异带

原因及对策：

1. 一抗不是唯一特异的，选择抗体时应注意看其说明书中是否有提示非特异性条带；

2. 二抗出现非特异结合，可以设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合。

（5）膜的背景太高

原因及对策：

1. 膜没有均匀浸湿，转膜前用 100% 甲醇将膜完全浸湿；

2. 抗体浓度过高，杂交前检测一抗、二抗的最适浓度；

3. 使用的封闭液浓度不适于杂交，多次实验找到最适封闭液浓度；

4. 洗涤不充分，可增加洗涤次数。