【讨论】关于western blot实验的一些问题

各位western达人，本人在western操作中屡次失败，现有几个问题跟达人们请教一下：
1、我的蛋白是96kDa,选择8%的分离胶有没有问题？
2、配制浓缩胶我用的是0.5M Tris-HCL(PH=6.8)，但是看到好多配方用的都是1.0MTris-HCL(PH=6.8)，这个有没有什么影响？
3、转膜是用的300mA,40min，看着转膜后胶很干净，就一直用的这个电流和时间。但是最后膜上总是很乱，背景高，也有好多小点，不知是不是转膜没转好？
4、我的一抗原液是用含2%蔗糖的PBS配的，是不是就应该用这种PBS稀释使用呢？
5、用封闭液稀释抗体的话，抗体能重复利用多少次？担心封闭液中的蛋白容易污染抗体。

1,没有问题
2，没有问题，重要的是你的终浓度，而不是母液浓度
3，湿式？可以稍微延长一下转膜时间，要保持低温，把槽子埋在冰里或放冷柜里
4，用封闭液就可以，加0.3%的叠氮钠
5，取决于抗体，抗体好的话至少5,6次总可以

首先感谢2楼的回复。但是还想问一下，封闭时加0.3%的叠氮钠目的是什么呢？我从来没加过，并且抗体都是用TBST稀释的，不知是不是有影响？
我前几次做的膜是孵的荧光二抗，到Odesay上看结果时，背景总是很杂乱，一片红红绿绿的，还有很多杂点，找不出是什么原因