【专题讨论】Western-blot
丁香园论坛
3540
蛋白样品制备
一、实验试剂与器材
1×PBS，细胞裂解液，组织块，上样缓冲液，细胞刮，移液器，EP管，均浆器，离心机，加热器
二、实验步骤
事先准备好碎冰，干净的均浆器插在冰上。准备好各种枪头、移液器、EP管、切组织用的消过毒的手术刀、干净的玻璃板和事先准备好的裂解液（根据需要加入合适浓度的蛋白酶抑制剂）
↓
迅速取出低温冻存的组织块，各样品切取合适大小使称重尽量一致
↓
将组织低温中研碎，然后倒入EP管，加入裂解液冰上裂解。
↓
组织被充分研碎后置于冰上裂解20min,用1ml注射器对裂解液反复抽吸10-20次，再继续裂解10分钟。4°C，12000rpm离心20min
↓
用吸引器小心吸出上清液，加入适量细胞裂解液，吹悬，冰上裂解15-20min。用1ml注射器对裂解液反复抽吸10-20次，再继续裂解10min。4°C，12000rpm离心20min.
上清移入新的1.5ml离心管，即为所需的蛋白样品。
↓
如果需要定量，吸入20-30μl蛋白提取液转入另外的EP管保存备用定量用。
↓
像其余蛋白样品中加入其1／4体积（5×上样缓冲液）或1／2体积（2×上样缓冲液），沸水中煮5min.
↓
12000rpm离心5min，所得即为制备好的蛋白样品。保存于-70°C冰箱待用。
蛋白定量
一、实验试剂与器材
未加入上样缓冲液的蛋白样品，细胞裂解液，蛋白标准品（2000μg／ml）,BAC蛋白定量试剂盒，EP管，96孔板，移液器，37°C孵箱，酶标仪，安有统计软件SPSS和Office的Excel软件的计算机。
二、实验步骤
1、 取一定量未加入上样缓冲液的蛋白样品置于0.5ml离心管，用细胞裂解液稀释5-10倍，终体积为10μl，保存于4°C冰箱。
↓
2、 按说明在0-2000μg／ml范围内设置9个蛋白浓度值，冰上用细胞裂解液及标准品蛋白（2000μg／ml）配制蛋白定量标准品1-9号，保存于4°C备用。注意：每吸取1次液体都要换新的枪头！操作要在冰上进行。操作前各个EP管一定要标记好顺序，按次序操作，以免误操作导致整个过程的失败。
↓
3、 按说明配制适量体积工作液，A液：B液=1:50.经验公式：工作液体积=A液体积+B液体积。A液体积=（9+样品个数）×200，B液体积= A液体积／50，单位为微升。
↓
4、 取一新的96孔板，每孔加入工作液200ml，所加孔数=9+蛋白样品数，然后迅速加入备用的蛋白定量标准品及稀释好的蛋白样品，加入体积均为10μl.
↓
5、 将96孔板置于37°C孵箱，反应30min.
↓
6、 取出96孔板，冷却至室温，注意吹去形成的气泡，酶标仪在560nm波长下测定吸光度。
↓
7、 在所得吸光度数据基础上，结合已知设置好的9个标准品蛋白的浓度数据，利用Excel或SPSS软件制作蛋白浓度标准曲线，得到回归方程，利用方程及蛋白样品吸光度值计算蛋白样品浓度。注意蛋白稀释的倍数。最后根据蛋白样品浓度及上样所需总蛋白量确定蛋白样品上样体积。
↓
8、 最后得到的蛋白标准曲线回归方程的相关系数应大于0.98.
蛋白质电泳
原理：利用电场的作用，分离不同分子量大小的蛋白质。
一、实验试剂及器材
制备好的蛋白样品，蛋白marker，4×下层胶缓冲液（1.5mol∕L Tris-HCI,pH8.8）, 4×上层胶缓冲液（0.5mol∕L Tris-HCI,pH6.8）,30%AB，10%SDS，10%ＡＰ，去离子水，ＴＥＭＥＤ，Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ ，甘氨酸，ＳＤＳ粉末，移液器，一次性塑料手套，电泳电源，电泳器材
二，实验步骤
１、组装好玻璃板，用去离子水确定无渗漏。每次ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ 检查完毕后，认真清洗玻璃板，避免留下胶粒影响下次运用。每次配胶之前，应该仔细检查玻璃板是否干净，有无遗留的小胶粒，测漏之前认真清洗玻璃板，以免影响配胶的质量。两块玻璃板在放置在胶垫上之前应先在平整的实验台面上码齐，夹上夹子后再放上胶垫，放上胶垫以后不要再松开夹子，否则容易造成底部渗漏。去离子水测漏的水平是５ｍｉｎ左右水面无明显下降即可（下降小余２ｍｍ）。确定无渗漏后用吸水纸吸出内部的水，不要再打开夹子或调整胶垫。配制下层胶，混均后将胶迅速加入玻璃板中，高度为距薄玻璃板上缘１．５ｃｍ左右，立即加入５００μｌ正丁醇封胶。２０－３０ｍｉｎ后待下层胶凝固完毕，用滤纸吸净正丁醇，然后把配制的上层胶迅速加到玻璃板中，随即插入成孔器。２０－３０ｍｉｎ后待上层胶凝固完毕，备用。如果配好胶拟在第２天用，可以用保鲜膜包好胶板，４°C保存，但是现用现配的效果最好。
↓
２、配制电泳缓冲液
↓
３、组装电泳装置 取下配好胶的玻璃板，拔出成孔器，选择与玻璃板匹配的电泳装置进行组装。组装好后，先向内槽加入加入电泳缓冲液至液面与玻璃板平齐，确定无渗漏后，向槽外加入适量电泳缓冲液。如有渗漏，需重新组装。孔内少量的气泡一般当内槽液流入后即可冲出，但是如果孔内残存小的质粒则需用１ｍｌ注射器针头吸出，以免影响上样。电泳装置加入外槽液后要小心清楚槽底部的气泡，以免影响电泳质量。
↓
４、上样，电泳 取制备好的蛋白样品，使用期沸水煮5min，12000rpm离心1min.使用移液器和加样枪头向加样孔加入蛋白Marker及蛋白样品，连接导线，注意正负极不要接反，接通电源，电压为上层胶120V，下层胶160V，约90min后可见蓝色线条移动至玻璃板低端，提示电泳结束，关闭电源。
转膜
使用试剂和器材
电泳完毕的内含蛋白质分子的聚丙烯酰胺凝胶，去离子水，Tris碱，甘氨酸，甲醇，NC膜或PVDF膜，滤纸，剪刀，平头镊子，转膜电源，转膜器材
实验步骤：
1、配制转移缓冲液
↓
2、组装转膜夹子：先将转膜夹子（一面为黑），衬垫，剪好的NC膜（PVDF膜用甲醇浸泡）及双层滤纸在转移缓冲液里浸泡15min。然后，组装转膜夹子，将夹子在转移液中展开，向夹子黑面依次放上衬垫、双层滤纸、电泳完毕的凝胶、NC膜、双层滤纸、衬垫，小心合上夹子。
↓
3、组装转膜装置、转膜 讲装置好的转膜夹子装入转移槽，夹子黑面在转移槽黑面一侧，白面在转移槽红面一侧。将转移槽倒满转移液，并放入一个冰袋，连接导线，注意正负极不要接反，将转移槽置于一加满冰块的泡沫盒中（注意直接将注意装置放在泡沫盒底上，再于周围加入碎冰，如果转移装置底部也放冰的话，转移过程中底部的冰融化后常常导致装置下坠，电极断开转膜失败），接通电源，100V转移2h或更长时间。转移结束后关闭电源。
抗体杂交
原理：利用抗原、抗体特异结合作用使结合于膜上的目的蛋白被一抗、二抗特异性标记
实验试剂及器材
结合有蛋白质分子的NC膜或PVDF膜，一抗及二抗，去离子水，1%丽春红染剂，Tween-20,Tris碱，NaCI,脱脂奶粉，剪刀，6cm平皿，平头镊子，移液器，封口机，避光盒，塑料袋
实验步骤
１、 配制TBST缓冲液
↓
２、 将转膜夹子从转膜装置中取出、打开，用平头镊子将NC膜或PVDF膜移入装有1%丽春红的平皿中，染色30s或更长时间，此时应该肯定膜上有整齐的粉红色蛋白条带，蛋白Marker泳道只有标定分子量的蛋白条带，用圆珠笔标记Marker泳道的蛋白条带，剪去多余的部分。
↓
３、 将标记好Marker、剪裁好的膜移入装有TBST缓冲液的平皿中，摇床设为80rmp，洗去然在膜上的丽春红，洗涤期间适时更换TBST缓冲液，洗约5-10min.
↓
４、 用TBST配制含5%脱脂奶粉的封闭缓冲液40ml，将洗去丽春红的膜移入装有封闭缓冲液的平皿，摇床设为60rpm，室温条件封闭1h.
↓
５、 使用TBST配制适当稀释度的一抗封闭缓冲液，将经过脱脂奶粉封闭的膜置入一合适大小的干净塑料袋，加入配好的一抗缓冲液，封口机封口，摇床设为60rpm，室温条件封闭1h。注意：采用封口机封口时注意塑料袋在横轴和纵轴方向上摆放一致，压膜的电压适当选择好，压膜时间要在封口机红灯熄灭后再压5-6s开启，可以减少皱褶及渗漏机会。
↓
６、 确保装有膜的塑料袋保持平整的放置于4°C冰箱，使NC膜各处均有一抗接触，放置过夜。
↓
７、 从冰箱取出装有膜的塑料袋，剪开口，用平头镊子将膜取出，置于装有TBST的平皿中，洗涤，摇床设为80rpm，洗3-4次，每次5-10min
↓
８、 使用TBST配制适当稀释度的辣根过氧化酶标记的二抗封闭缓冲液，将洗过的膜置入一合适大小的干净的塑料袋中，加入配好的二抗缓冲液，封口机封口，摇床设为60rpm，室温条件下封闭1h
↓
９、 接7，亦可选用荧光素标记的二抗，同样使用TBST配制适当稀释度的二抗封闭缓冲液。此时应将二抗封闭缓冲液装入可以遮光的盒子，以避免荧光淬灭。将膜置于盒子中，摇床设为60rpm，室温条件下封闭1h
↓
１０、 接8，将二抗封闭后的塑料袋剪开口，用平头镊子将膜取出，置于装有TBST的平皿中，洗涤，摇床设为80rpm，洗3-4次，每次5-10min，留待发光检测。
↓
１１、 接9，将膜扔置于遮光的盒子中，用TBST洗涤，摇床设定为80rpm，洗3-4次，每次5-10min留待仪器扫描。
发光检测或荧光扫描
原理：二抗上标记的辣根过氧化酶催化底物从而发光，用X光片将光信号记录，通过显影、定影过程获得肉眼可见的条带，此条带即标识了目的蛋白。
实验试剂及器材
结合有一抗二抗的NC膜或PVDF膜，发光液，显影液，滤纸，X光片，压片盒，剪刀，6cm平皿，平头镊子，移液器，保鲜膜，定时器，塑胶手套
实验步骤
1、在避光条件下配制适量发光工作液 实际上是相应二抗酶的底物，相互作用后发出，A液：B液=1:1.所需工作液的量由膜的面积决定，液体量满足可将整张膜覆盖即可。
↓
2、准备发光所需物品 洗涤完毕的膜，X光片，配制好的发光液，显影液，定影液，剪刀，滤纸，移液器，压片盒，保鲜膜，定时器。上述物品放置于暗室。
↓
3、压片 此后操作均在暗室中戴塑胶手套进行。将压片盒打开，覆盖一层保鲜膜。用平头镊子将膜从TBST中取出，滤纸吸去膜背面的水分，将膜放到压片盒里，正面（标有Marker）向上，用移液器向膜上滴加配好的发光液，使整张膜都被覆盖。5min后（此时应该可见到膜上有明亮的发光条带）将保鲜膜反折，小心的覆盖于膜上。此时关闭日光灯，打开红灯，剪取稍大于膜的X光片，剪掉左上角（即做一标记），将X光片小心的压于膜上。盖上压片盒的盖子。压片10s至10min，也可更长时间。
↓
4、显影 打开压片盒，取出X光片，置于显影液中显影，10s至1min左右，也可更长时间。显影时间过长会导致整个光胶片变黑，应根据所采用的系统调整合适的时间
↓
5、定影 从显影液中取出X光片，在清水中稍作洗涤，然后放入定影液中定影，时间2-5min
↓
6、重复压片 可重复压多张X光片，操作基本相同，可尝试不同的压片时间和显影时间。
↓
7、晾片 操作完毕后，将X光片和显影液收起，此时方可打开日光灯。将定影完毕的X光片放入清水中洗涤、晾干，留待分析。
↓
8、仪器扫描
一、实验试剂与器材
1×PBS，细胞裂解液，组织块，上样缓冲液，细胞刮，移液器，EP管，均浆器，离心机，加热器
二、实验步骤
事先准备好碎冰，干净的均浆器插在冰上。准备好各种枪头、移液器、EP管、切组织用的消过毒的手术刀、干净的玻璃板和事先准备好的裂解液（根据需要加入合适浓度的蛋白酶抑制剂）
↓
迅速取出低温冻存的组织块，各样品切取合适大小使称重尽量一致
↓
将组织低温中研碎，然后倒入EP管，加入裂解液冰上裂解。
↓
组织被充分研碎后置于冰上裂解20min,用1ml注射器对裂解液反复抽吸10-20次，再继续裂解10分钟。4°C，12000rpm离心20min
↓
用吸引器小心吸出上清液，加入适量细胞裂解液，吹悬，冰上裂解15-20min。用1ml注射器对裂解液反复抽吸10-20次，再继续裂解10min。4°C，12000rpm离心20min.
上清移入新的1.5ml离心管，即为所需的蛋白样品。
↓
如果需要定量，吸入20-30μl蛋白提取液转入另外的EP管保存备用定量用。
↓
像其余蛋白样品中加入其1／4体积（5×上样缓冲液）或1／2体积（2×上样缓冲液），沸水中煮5min.
↓
12000rpm离心5min，所得即为制备好的蛋白样品。保存于-70°C冰箱待用。
蛋白定量
一、实验试剂与器材
未加入上样缓冲液的蛋白样品，细胞裂解液，蛋白标准品（2000μg／ml）,BAC蛋白定量试剂盒，EP管，96孔板，移液器，37°C孵箱，酶标仪，安有统计软件SPSS和Office的Excel软件的计算机。
二、实验步骤
1、 取一定量未加入上样缓冲液的蛋白样品置于0.5ml离心管，用细胞裂解液稀释5-10倍，终体积为10μl，保存于4°C冰箱。
↓
2、 按说明在0-2000μg／ml范围内设置9个蛋白浓度值，冰上用细胞裂解液及标准品蛋白（2000μg／ml）配制蛋白定量标准品1-9号，保存于4°C备用。注意：每吸取1次液体都要换新的枪头！操作要在冰上进行。操作前各个EP管一定要标记好顺序，按次序操作，以免误操作导致整个过程的失败。
↓
3、 按说明配制适量体积工作液，A液：B液=1:50.经验公式：工作液体积=A液体积+B液体积。A液体积=（9+样品个数）×200，B液体积= A液体积／50，单位为微升。
↓
4、 取一新的96孔板，每孔加入工作液200ml，所加孔数=9+蛋白样品数，然后迅速加入备用的蛋白定量标准品及稀释好的蛋白样品，加入体积均为10μl.
↓
5、 将96孔板置于37°C孵箱，反应30min.
↓
6、 取出96孔板，冷却至室温，注意吹去形成的气泡，酶标仪在560nm波长下测定吸光度。
↓
7、 在所得吸光度数据基础上，结合已知设置好的9个标准品蛋白的浓度数据，利用Excel或SPSS软件制作蛋白浓度标准曲线，得到回归方程，利用方程及蛋白样品吸光度值计算蛋白样品浓度。注意蛋白稀释的倍数。最后根据蛋白样品浓度及上样所需总蛋白量确定蛋白样品上样体积。
↓
8、 最后得到的蛋白标准曲线回归方程的相关系数应大于0.98.
蛋白质电泳
原理：利用电场的作用，分离不同分子量大小的蛋白质。
一、实验试剂及器材
制备好的蛋白样品，蛋白marker，4×下层胶缓冲液（1.5mol∕L Tris-HCI,pH8.8）, 4×上层胶缓冲液（0.5mol∕L Tris-HCI,pH6.8）,30%AB，10%SDS，10%ＡＰ，去离子水，ＴＥＭＥＤ，Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ ，甘氨酸，ＳＤＳ粉末，移液器，一次性塑料手套，电泳电源，电泳器材
二，实验步骤
１、组装好玻璃板，用去离子水确定无渗漏。每次ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ 检查完毕后，认真清洗玻璃板，避免留下胶粒影响下次运用。每次配胶之前，应该仔细检查玻璃板是否干净，有无遗留的小胶粒，测漏之前认真清洗玻璃板，以免影响配胶的质量。两块玻璃板在放置在胶垫上之前应先在平整的实验台面上码齐，夹上夹子后再放上胶垫，放上胶垫以后不要再松开夹子，否则容易造成底部渗漏。去离子水测漏的水平是５ｍｉｎ左右水面无明显下降即可（下降小余２ｍｍ）。确定无渗漏后用吸水纸吸出内部的水，不要再打开夹子或调整胶垫。配制下层胶，混均后将胶迅速加入玻璃板中，高度为距薄玻璃板上缘１．５ｃｍ左右，立即加入５００μｌ正丁醇封胶。２０－３０ｍｉｎ后待下层胶凝固完毕，用滤纸吸净正丁醇，然后把配制的上层胶迅速加到玻璃板中，随即插入成孔器。２０－３０ｍｉｎ后待上层胶凝固完毕，备用。如果配好胶拟在第２天用，可以用保鲜膜包好胶板，４°C保存，但是现用现配的效果最好。
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２、配制电泳缓冲液
↓
３、组装电泳装置 取下配好胶的玻璃板，拔出成孔器，选择与玻璃板匹配的电泳装置进行组装。组装好后，先向内槽加入加入电泳缓冲液至液面与玻璃板平齐，确定无渗漏后，向槽外加入适量电泳缓冲液。如有渗漏，需重新组装。孔内少量的气泡一般当内槽液流入后即可冲出，但是如果孔内残存小的质粒则需用１ｍｌ注射器针头吸出，以免影响上样。电泳装置加入外槽液后要小心清楚槽底部的气泡，以免影响电泳质量。
↓
４、上样，电泳 取制备好的蛋白样品，使用期沸水煮5min，12000rpm离心1min.使用移液器和加样枪头向加样孔加入蛋白Marker及蛋白样品，连接导线，注意正负极不要接反，接通电源，电压为上层胶120V，下层胶160V，约90min后可见蓝色线条移动至玻璃板低端，提示电泳结束，关闭电源。
转膜
使用试剂和器材
电泳完毕的内含蛋白质分子的聚丙烯酰胺凝胶，去离子水，Tris碱，甘氨酸，甲醇，NC膜或PVDF膜，滤纸，剪刀，平头镊子，转膜电源，转膜器材
实验步骤：
1、配制转移缓冲液
↓
2、组装转膜夹子：先将转膜夹子（一面为黑），衬垫，剪好的NC膜（PVDF膜用甲醇浸泡）及双层滤纸在转移缓冲液里浸泡15min。然后，组装转膜夹子，将夹子在转移液中展开，向夹子黑面依次放上衬垫、双层滤纸、电泳完毕的凝胶、NC膜、双层滤纸、衬垫，小心合上夹子。
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3、组装转膜装置、转膜 讲装置好的转膜夹子装入转移槽，夹子黑面在转移槽黑面一侧，白面在转移槽红面一侧。将转移槽倒满转移液，并放入一个冰袋，连接导线，注意正负极不要接反，将转移槽置于一加满冰块的泡沫盒中（注意直接将注意装置放在泡沫盒底上，再于周围加入碎冰，如果转移装置底部也放冰的话，转移过程中底部的冰融化后常常导致装置下坠，电极断开转膜失败），接通电源，100V转移2h或更长时间。转移结束后关闭电源。
抗体杂交
原理：利用抗原、抗体特异结合作用使结合于膜上的目的蛋白被一抗、二抗特异性标记
实验试剂及器材
结合有蛋白质分子的NC膜或PVDF膜，一抗及二抗，去离子水，1%丽春红染剂，Tween-20,Tris碱，NaCI,脱脂奶粉，剪刀，6cm平皿，平头镊子，移液器，封口机，避光盒，塑料袋
实验步骤
１、 配制TBST缓冲液
↓
２、 将转膜夹子从转膜装置中取出、打开，用平头镊子将NC膜或PVDF膜移入装有1%丽春红的平皿中，染色30s或更长时间，此时应该肯定膜上有整齐的粉红色蛋白条带，蛋白Marker泳道只有标定分子量的蛋白条带，用圆珠笔标记Marker泳道的蛋白条带，剪去多余的部分。
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３、 将标记好Marker、剪裁好的膜移入装有TBST缓冲液的平皿中，摇床设为80rmp，洗去然在膜上的丽春红，洗涤期间适时更换TBST缓冲液，洗约5-10min.
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４、 用TBST配制含5%脱脂奶粉的封闭缓冲液40ml，将洗去丽春红的膜移入装有封闭缓冲液的平皿，摇床设为60rpm，室温条件封闭1h.
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５、 使用TBST配制适当稀释度的一抗封闭缓冲液，将经过脱脂奶粉封闭的膜置入一合适大小的干净塑料袋，加入配好的一抗缓冲液，封口机封口，摇床设为60rpm，室温条件封闭1h。注意：采用封口机封口时注意塑料袋在横轴和纵轴方向上摆放一致，压膜的电压适当选择好，压膜时间要在封口机红灯熄灭后再压5-6s开启，可以减少皱褶及渗漏机会。
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６、 确保装有膜的塑料袋保持平整的放置于4°C冰箱，使NC膜各处均有一抗接触，放置过夜。
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７、 从冰箱取出装有膜的塑料袋，剪开口，用平头镊子将膜取出，置于装有TBST的平皿中，洗涤，摇床设为80rpm，洗3-4次，每次5-10min
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８、 使用TBST配制适当稀释度的辣根过氧化酶标记的二抗封闭缓冲液，将洗过的膜置入一合适大小的干净的塑料袋中，加入配好的二抗缓冲液，封口机封口，摇床设为60rpm，室温条件下封闭1h
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９、 接7，亦可选用荧光素标记的二抗，同样使用TBST配制适当稀释度的二抗封闭缓冲液。此时应将二抗封闭缓冲液装入可以遮光的盒子，以避免荧光淬灭。将膜置于盒子中，摇床设为60rpm，室温条件下封闭1h
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１０、 接8，将二抗封闭后的塑料袋剪开口，用平头镊子将膜取出，置于装有TBST的平皿中，洗涤，摇床设为80rpm，洗3-4次，每次5-10min，留待发光检测。
↓
１１、 接9，将膜扔置于遮光的盒子中，用TBST洗涤，摇床设定为80rpm，洗3-4次，每次5-10min留待仪器扫描。
发光检测或荧光扫描
原理：二抗上标记的辣根过氧化酶催化底物从而发光，用X光片将光信号记录，通过显影、定影过程获得肉眼可见的条带，此条带即标识了目的蛋白。
实验试剂及器材
结合有一抗二抗的NC膜或PVDF膜，发光液，显影液，滤纸，X光片，压片盒，剪刀，6cm平皿，平头镊子，移液器，保鲜膜，定时器，塑胶手套
实验步骤
1、在避光条件下配制适量发光工作液 实际上是相应二抗酶的底物，相互作用后发出，A液：B液=1:1.所需工作液的量由膜的面积决定，液体量满足可将整张膜覆盖即可。
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2、准备发光所需物品 洗涤完毕的膜，X光片，配制好的发光液，显影液，定影液，剪刀，滤纸，移液器，压片盒，保鲜膜，定时器。上述物品放置于暗室。
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3、压片 此后操作均在暗室中戴塑胶手套进行。将压片盒打开，覆盖一层保鲜膜。用平头镊子将膜从TBST中取出，滤纸吸去膜背面的水分，将膜放到压片盒里，正面（标有Marker）向上，用移液器向膜上滴加配好的发光液，使整张膜都被覆盖。5min后（此时应该可见到膜上有明亮的发光条带）将保鲜膜反折，小心的覆盖于膜上。此时关闭日光灯，打开红灯，剪取稍大于膜的X光片，剪掉左上角（即做一标记），将X光片小心的压于膜上。盖上压片盒的盖子。压片10s至10min，也可更长时间。
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4、显影 打开压片盒，取出X光片，置于显影液中显影，10s至1min左右，也可更长时间。显影时间过长会导致整个光胶片变黑，应根据所采用的系统调整合适的时间
↓
5、定影 从显影液中取出X光片，在清水中稍作洗涤，然后放入定影液中定影，时间2-5min
↓
6、重复压片 可重复压多张X光片，操作基本相同，可尝试不同的压片时间和显影时间。
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7、晾片 操作完毕后，将X光片和显影液收起，此时方可打开日光灯。将定影完毕的X光片放入清水中洗涤、晾干，留待分析。
↓
8、仪器扫描
