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Western Blot常见问题总结

钰森生物

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Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与或标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

关于Western Blot技术,我们实验室凭着几年来的丰富经验,总结出以下几点建议:

1.抗体的选择 对于国内的大多数实验室来讲,做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单,买进口抗体捉襟见肘,买国产抗体得需要大无畏的勇气。在我们实验室western blot实验历程里,我们用过进口抗体,进口抗体国内分装包装,国产抗体,质量良莠不齐。 进口抗体一般不会出现闪失:Abcam品种全,质量过硬,但价高;Sigma的价最贵;比较有性价比的是CST的抗体,不足是CST的品种不多。Santa的多克隆抗体质量可以,但是选用Santa的单抗还是有风险,估计这也是业界共识了吧。

进口抗体国内分装包装我们也用过不少,大概好抗体的比例约为50%,如果能做出来,也存在一个问题,就是抗体大多只能用一次国产抗体比较知名的就几家,但质量确实不敢恭维。Western blot能做出来的确实不多,而且杂带多,背景不干净。

2. Western Blot实验条件 具体的试剂配方我们是按宝生物试剂册的附录部分配制转移电泳缓冲液可以回收再用两次。转膜我们是300毫安/2小时,转膜一定得做冰水浴,就是把槽子泡在冰水混合液里。

3.关于奶粉,膜的选择 奶粉看似简单,其实很重要,如果要凑合,可以到超市买脱脂奶粉。奶粉质量不好,会最终导致显影要么漆黑一片,要么啥都没。我们现在用的BD的,很好很稳定,可回收利用。 NC膜,PVDF膜我们都用过, PVDF膜的好处是蛋白载量大,韧性好。唯一的麻烦是事先得用甲醇泡几分钟,目的是为了增强膜的正电荷。甲醇泡完后,得在转移缓冲液里泡一两分钟。

4 .关于显色液 我们选用进口超敏ECL显色液。用普通的显色液检测内参一般都没问题,但对于表达量比较低的蛋白就不容易显色出来,而超敏的就不一样,即使蛋白表达量很低,也可以检测出来。

5. Western Blot实验关键 Western Blot操作步骤多,每一步的失误都会造成全盘失败,综合而言,抗体仍然是决定成败的关键,如果抗体不好,就是神仙也没招。其中内参抗体很重要,因为内参抗体的选择关系到全盘实验的考评。Actin,Tubulin,GAPDH我们都用过,Actin,Tubulin的缺点是有时候会出现复带,比较稳定的还是GAPDH。如果用心看看cell,nature,science上的文章,大多用GAPDH做内参。进口的,国内分装的,国产的,我们都用过,效果都还可以。

从western实验我们总结出,实验上根本省不下来钱,一个环节的烂货就会导致全盘失败。对于实验设计而言,也是如此,一个步骤的疏忽会导致整个实验立题和评估的逻辑混乱。如果要追求性价比,也就是如何发挥穷人的劳斯莱斯的最大收益,那从一开始就要按秋后算账的原则选择试剂,要算总账;如果要让实验顺顺利利,那就得注意每一个环节,步步为营,细节决定成败。到现在,只要抗体work,几乎没有我们做不出来的分子,Western给了我们无穷的自信。

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