【原创】Western Blot经验总结
丁香园论坛
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以前自己总结的Western Blot经验。原先看到版上WB资料泛滥，不想发了。但是后来想想存在电脑里也是浪费，还不如共享一下：）
希望对大家有用！
1、缓冲液的选择，是用PBS/PBST，还是用TBS/TBST？
（1）PBS/PBST不适合AP系列，TBS/TBST适合AP和HRP体系。
（2）另外,做磷酸化蛋白的WB，PBS不合适。
2、如果用HRP体系，那么不能用叠氮钠做防腐剂。因为叠氮钠会抑制HRP的作用。
3、WB中抗体的选择：
单抗专一性高，但是经过SDS－PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别。多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。
4、简易的WB——“不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件（稀释度），可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂”
5、WB中Tween－20的作用：
吐温是一种非离子型表面活性剂，可以洗掉一些非特异性结合的蛋白和抗体，降低背景。
6、ECL荧光淬灭的问题：
二抗浓度过高，HRP浓度过高，会超速催化底物生成产物使膜发黄。所以二抗浓度太低了不行，太高了由于会出现卒灭的现象也行不通。
常见问题及解决方法：
（1）弱信号或者无信号：在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物！解决办法：加入底物后迅速进入暗室，压片10秒钟！或者适当降低2抗浓度。
（2）反影(白色条带,黑色背景) ：条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光，不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。解决方法同上。
（3）另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是弱信号或者无信号，解决方法同上。
7、 western 背景深原因：
（1）封闭的不好。封闭试剂不合适等。
（2）洗涤不充分。洗涤液的量过低等。
（3）样品浓度过高。
（4）抗体浓度（特别是二抗浓度）过高。
8、 蛋白丰度不同时，加入ECL后的哺育时间及曝光时间。
（1）蛋白丰度高，在目的条带位置处HRP浓度极高，很容易出现荧光淬灭的现象。因此当蛋白丰度高时，哺育时间要尽量短（如1min）以免出现荧光淬灭，曝光时间也要尽可能短（如10Sec）以免背景过高。
（2）蛋白丰度低时，在目的条带位置处HRP浓度极低。则要适当延长哺育时间（如7min）使得反应尽可能充分，曝光时间也适当延长（如10min）。
9、Western中的正反面问题。
首先，PVDF膜本身是不区分正反面的，两面都可以用。但是转膜之后就分为与胶直接接触的一面和不直接接触的一面。有一种说法认为转膜后，蛋白存在于与胶直接接触的一面，因此，加ECL时要加在与胶直接接触的那面上。另一种说法则认为，转膜后蛋白并不是简单的粘在膜上，而是嵌入膜中了，所以膜的两面都有蛋白，ECL随便加在哪一边。个人同意第二种说话，但是由于转膜的程度不同，两面所含的蛋白量也可能不同。
10、在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的
蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
11、ECL是什么？
ECL（electronic ChemiLuminescence)是指一种方法、原理，是利用电解的氧化还原产物
之间或与体系中某一组分进行化学反应而发光的一种分析法.Western-blotting 中指电化
学发光免疫法。其原理：辣根过氧化酶使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而
试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。Luminol发生氧化降解，并发射波长为
428nm的光，此光可经X光片（放射自显影片）感光记录下来。
12、Too many bands on a Western blot
In western blotting, It is not uncommon that, contrary to the theoretical predictions, several bands are detected. Although it is possible that the antibody is not entirely specific for the protein, other factors may be responsible:
(1)Proteolytic breakdown of the antigen. This is not uncommon, particularly if samples are stored for prolonged time or if proteins or membranes are fractionated after homogenization of the starting tissue. All additional bands are of lower apparent molecular mass than the full-length protein. Particularly susceptible are synapsins and synaptotagmins. Addition of protease inhibitors such as PMSF, pepstatin or leupeptin should be considered.
(2)Too much protein per lane or detection system too sensitive. Overloading of the gel is one of the most common reasons for "ghost bands". Immobilized proteins may provide a concentrated adsorbtive surface to which certain IgG may bind nonspecifically. Similarly, such nonspecific binding may be uncovered when highly sensitive detection systems such as enhanced chemoluminescence are employed. A dilution series of the starting material usually clarifies which of the signals are artefactual.
(3)Ineffecient blocking. A variety of different blocking agents are described in the literature including nonionic detergents and/or proteins. Change of the blocking conditions may remedy the problem.
(4)Concentration of antigen too low. The resolution of SDS-PAGE is limited to 50-100 bands. If the relative concentration of the antigen of interest is too low (less than 0.2% of total protein), it may be difficult to detect (for instance, synaptobrevin/VAMP comigrates with histones in cell homogenates which interfere with its detection). Signal enhancement may then lead to the appearance of artificial bands. Enrichment of the antigen by fractionation or by immunoprecipitation should be considered.
希望对大家有用！
1、缓冲液的选择，是用PBS/PBST，还是用TBS/TBST？
（1）PBS/PBST不适合AP系列，TBS/TBST适合AP和HRP体系。
（2）另外,做磷酸化蛋白的WB，PBS不合适。
2、如果用HRP体系，那么不能用叠氮钠做防腐剂。因为叠氮钠会抑制HRP的作用。
3、WB中抗体的选择：
单抗专一性高，但是经过SDS－PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别。多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。
4、简易的WB——“不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件（稀释度），可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂”
5、WB中Tween－20的作用：
吐温是一种非离子型表面活性剂，可以洗掉一些非特异性结合的蛋白和抗体，降低背景。
6、ECL荧光淬灭的问题：
二抗浓度过高，HRP浓度过高，会超速催化底物生成产物使膜发黄。所以二抗浓度太低了不行，太高了由于会出现卒灭的现象也行不通。
常见问题及解决方法：
（1）弱信号或者无信号：在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物！解决办法：加入底物后迅速进入暗室，压片10秒钟！或者适当降低2抗浓度。
（2）反影(白色条带,黑色背景) ：条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光，不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。解决方法同上。
（3）另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是弱信号或者无信号，解决方法同上。
7、 western 背景深原因：
（1）封闭的不好。封闭试剂不合适等。
（2）洗涤不充分。洗涤液的量过低等。
（3）样品浓度过高。
（4）抗体浓度（特别是二抗浓度）过高。
8、 蛋白丰度不同时，加入ECL后的哺育时间及曝光时间。
（1）蛋白丰度高，在目的条带位置处HRP浓度极高，很容易出现荧光淬灭的现象。因此当蛋白丰度高时，哺育时间要尽量短（如1min）以免出现荧光淬灭，曝光时间也要尽可能短（如10Sec）以免背景过高。
（2）蛋白丰度低时，在目的条带位置处HRP浓度极低。则要适当延长哺育时间（如7min）使得反应尽可能充分，曝光时间也适当延长（如10min）。
9、Western中的正反面问题。
首先，PVDF膜本身是不区分正反面的，两面都可以用。但是转膜之后就分为与胶直接接触的一面和不直接接触的一面。有一种说法认为转膜后，蛋白存在于与胶直接接触的一面，因此，加ECL时要加在与胶直接接触的那面上。另一种说法则认为，转膜后蛋白并不是简单的粘在膜上，而是嵌入膜中了，所以膜的两面都有蛋白，ECL随便加在哪一边。个人同意第二种说话，但是由于转膜的程度不同，两面所含的蛋白量也可能不同。
10、在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的
蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
11、ECL是什么？
ECL（electronic ChemiLuminescence)是指一种方法、原理，是利用电解的氧化还原产物
之间或与体系中某一组分进行化学反应而发光的一种分析法.Western-blotting 中指电化
学发光免疫法。其原理：辣根过氧化酶使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而
试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。Luminol发生氧化降解，并发射波长为
428nm的光，此光可经X光片（放射自显影片）感光记录下来。
12、Too many bands on a Western blot
In western blotting, It is not uncommon that, contrary to the theoretical predictions, several bands are detected. Although it is possible that the antibody is not entirely specific for the protein, other factors may be responsible:
(1)Proteolytic breakdown of the antigen. This is not uncommon, particularly if samples are stored for prolonged time or if proteins or membranes are fractionated after homogenization of the starting tissue. All additional bands are of lower apparent molecular mass than the full-length protein. Particularly susceptible are synapsins and synaptotagmins. Addition of protease inhibitors such as PMSF, pepstatin or leupeptin should be considered.
(2)Too much protein per lane or detection system too sensitive. Overloading of the gel is one of the most common reasons for "ghost bands". Immobilized proteins may provide a concentrated adsorbtive surface to which certain IgG may bind nonspecifically. Similarly, such nonspecific binding may be uncovered when highly sensitive detection systems such as enhanced chemoluminescence are employed. A dilution series of the starting material usually clarifies which of the signals are artefactual.
(3)Ineffecient blocking. A variety of different blocking agents are described in the literature including nonionic detergents and/or proteins. Change of the blocking conditions may remedy the problem.
(4)Concentration of antigen too low. The resolution of SDS-PAGE is limited to 50-100 bands. If the relative concentration of the antigen of interest is too low (less than 0.2% of total protein), it may be difficult to detect (for instance, synaptobrevin/VAMP comigrates with histones in cell homogenates which interfere with its detection). Signal enhancement may then lead to the appearance of artificial bands. Enrichment of the antigen by fractionation or by immunoprecipitation should be considered.
