蛋白质实验锦囊

（1）杂交信号很弱，条带浅，如下图原因及对策：1. 蛋白量太少，可以适当增加蛋白上样量；2. 抗体效价太低，可以适当加大抗体浓度；3. 过度漂洗膜，也可能会导致信号变弱、条带太浅；4. 转移到膜上的蛋白太少，当蛋白分子量 <10 KD 时，可减少转膜时间、使用小孔径的膜或配置厚度适当的凝胶。（2）条带上有单个或多个白点原因及对策：「三明治」结构不紧凑导致，夹板做「三明治」结构时要确保膜和胶块

1、提取时冰上操作，buffer 添加蛋白酶抑制剂；2、蛋白尽量同一批次提取、测定浓度，保存及使用情况尽量一致，防止部分样品有降解；3、蛋白提取后尽快测定浓度，添加标曲；4、最好调整为统一浓度后上样体积保持一致；5、每孔上样体积不宜过大或过少，不超过最大上样量，避免样品溢散污染；6、由于样品有一定粘滞性，枪头吸液后外壁会黏附一些，加样时需注意，使用长而细的枪头；7、相比等体积上样，如果可以，尽可能

使用 Photoshop（PS）处理 Western blot 条带及组图的过程：1. 打开 Western blot 图片，在 PS 中选择「文件」->「打开」并选择需要处理的 Western blot 图片文件；2. 调整图片大小和分辨率，可以使用「图像」->「图像大小」来调整 Western blot 图片的大小和分辨率，分辨率高于300 ppi；3. 调整图片对比度和亮度，使用

① 选择「文件」->「打开」打开要计算灰度的 wb 结果图；② 使用「矩形选定工具」选定有条带的区域，然后选择「Edit」->「Selection」->「Make Band」来将选定区域定义为条带，框起其中一个结果，按 ctrl+1；（注：矩形框的长要小于宽的两倍）③ 把框移动到下一个结果，按 ctrl+2；④ 重复步骤 ③，一直到所有的结果都选上；⑤按 ctrl+3 进行计算；

1、厚薄玻璃板须洁净，干燥，夹板架固定好玻璃板，注意不要漏液，注意两块玻璃板底部保持平齐；2、分离胶和积层胶溶液必须充分混匀，加入 AP、TEMED 后迅速轻摇混匀，灌入两块玻璃板间隙中；3、用 1 mL 无水乙醇覆盖分离胶液面，阻断空气，分隔线会更加平直，待分离胶凝聚后倾斜架子，用滤纸吸干剩余的无水乙醇；4、梳子垂直插入两块玻璃板中间，注意避免梳子孔之间产生气泡，室温水平放置，待积层胶凝聚，轻轻

1、蛋白降解；对策：于冰上提取，buffer 里加蛋白酶抑制剂防止降解。2、样品保存不当；对策：提取后尽快测定浓度，并煮沸变性，未煮沸样品保存置于 -80 ℃ 保存。3、胶浓度较低，容易跑过头；对策：换用浓度较高的胶，例如 15% 或者用梯度胶。4、转膜时间太长，小分子蛋白转过头；对策：减少转膜时间，可尝试 200-250 mA 转 15-30 min 左右。5、膜孔径太大；对策：换用小孔径如 0

原因：内参与待检测蛋白质的表达水平不同；内参和待检测蛋白的尺寸和分子量不同可能导致它们在电泳和转移过程中的运移速度不同；技术问题：在所使用的薄膜、抗体和染色试剂等技术参数方面的差异会导致内参不均一。对策：选择特异性高、表达量适中的内参蛋白；调整待测蛋白质的负载量；尽可能选择使用相同的技术参数，减少技术差异导致的内参不齐。

1、纳米金浓度的优化：选择最适合的纳米金浓度，以便于纳米金能够稳定地分散在化学物中，并有助于实现最佳连接效果；2、pH 优化可提高单克隆抗体的活性和稳定性；3、选择合适的交联剂：若采用商用的交联剂，可选择常用的 EDC/NHS 交联剂，极易促进纳米金和单克隆抗体的连接效果；4、选择高活性和高特异性的单克隆抗体，并保持适宜的温度。

Elisa 实验中，单克隆抗体和多克隆抗体都可以作为捕获和检测抗体。一抗和二抗抗体识别的表位要有差异，两者物种来源一致，类别或亚类相匹配。抗体属性要与样品属性一致，比如样品是大鼠，则选大鼠来源的抗体。若自己包被 Elisa 抗体，则需要进入抗体公司网站首页（如 Thermo Fisher Scientific、Cell Signaling Technology 等），此处以 Thermo Fish

可能原因：1）抗体孵育的时间或温度不够；2）显色反应时间不足；3）实验中使用的缓冲液的有问题。解决：1）适当增加抗体孵育时间，于 37℃ 进行孵育反应；2）适当延长显色反应时间；3）配置缓冲液确保使用三蒸水，排除其他离子的干扰。

1、加样不准：更换量程更加精确的枪，操作更加仔细；2、实验过程存在污染：更换样品，重复实验；3、底物配制时间过长：更换底物，现配现用；4、试剂失效：查询各试剂有效期，更换试剂；5、配制溶液的水不纯净：更换双蒸水。

1）将酶标仪读出的标准品的 OD 值以及标准品浓度导成 Excel 文档；2）将上述数据导入标准曲线绘制软件（Elisa 试剂盒推荐的软件），以浓度为「X」轴，OD值为「Y」轴；3）选择回归/拟合模型（如：直线回归），拟合后，观察 r2 的值，越接近 1，拟合效果越好；4）通过标准曲线计算样品浓度：从 Excel 表中粘贴检测样品的 OD 值导入软件，经模拟曲线自动计算生成对应的样品浓度。

包涵体成因是蛋白表达过快，局部浓度过高，具有相互作用的蛋白聚合沉淀。因此避免包涵体方法如下：1、降低诱导温度温度，延长诱导时间（如 16 ℃，16 h）；2、减少诱导剂浓度（0.01–0.1mM）；3、在蛋白前融合进 MBP、TRX 等促溶标签；4、更换弱启动子；5、适当增加盐浓度，在蛋白溶剂中加入 10% 左右的甘油；6、改变诱导剂的类型和浓度：适当调整诱导剂的类型和浓度，如改变 IPTG 浓度

1、应及时开展效应实验；因为慢病毒敲低后，如果培养过长的话，细胞增殖过多，其生长状态会干扰实验结果。2、稳定株建立好后，可冻存多批代数较早的细胞，做效应实验时使用代数靠前的细胞，且传代次数不宜过多。一方面，细胞传代次数增加会使其理化性质改变，一些基因表型会丢失；另一方面，细胞多次传代后会使得干扰的基因收到代偿机制调节，促使干扰效果下调。3、若进行免疫相关的研究，建议慢病毒感染的稳定株，传代 2 次

原因：1）保存不当，反复冻融病毒； 2）病毒被污染； 3）细胞传代次数过多，对病毒的易感性下降； 4）病毒适应了细胞株，对病毒的易感性降低； 5）实验操作不一致，如病毒感染时间、感染剂量等不同； 6）病毒超离后重悬病毒的溶剂变化。解决：1）病毒样品根据需要进行分装，避免反复冻融； 2）病毒冻存于 -80 ℃ 保存； 3）每次转染时，选择代数靠的细胞株； 4）统一转染的时间和剂量； 5）统一重悬病毒

1）合理存放慢病毒，避免反复冻融；2）实验前，摸索确定病毒感染的 MOI；3）对于难感染的细胞进行二次感染；4）加入助转染试剂 polybrene 增大感染效率。

包括仪器、实验参数设置以及样品处理。如：1）色谱柱类型、损坏、被污染或者过载等；2）流动相配比、缓冲液容量；3）柱温、流速；4）采样过程不合理可能导致样品成分失去平衡，对峰形产生影响；5）样品制备过程中，如每次保存溶液时加入不必要的气体导致的溶解度变化，都可能导致峰形异常。

1、背景深可能是二抗稀释液不合适导致的，可以用奶粉、BSA 或专门的二抗稀释液，但是需要调节到适当的浓度，例如 2% 奶粉稀释液，1% BSA 稀释液，或是 5% BSA 稀释液，更有甚者可以增加到 10% BSA 稀释液，可多摸索几次，找到最适的浓度，有效降低背景深的问题。2、条带杂乱可能是抗体特异性不强，或是该抗体不适用于 Co-IP 实验，建议在使用抗体时阅读清楚该抗体的适用范围。

1、改变胶浓度，一般 5-6%；2、提高探针浓度：10 nM - 0.5 μM 范围内改变试试；3、适当减少上样量；4、更换探针，上述 3 点都尝试了不行的话可能是探针上没有结合位点，所以蛋白不下去，此时可以看到探针下去了，而蛋白没有下去，这需要更换探针才能解决。

1、蛋白降解或者蛋白在细胞系中表达低。对策：用蛋白跑一次 WB 可排除，若是这种情况，则需要更换样品或者加大样品量。2、探针上没有与蛋白结合的位点。对策：更换探针可解决。3、转膜效率低或者成像时间过短。对策：改善转膜条件，一般在 0.5X TBE 中恒压 60 V 转膜 1 h，最好放在冰上；成像时间也须从短时间逐渐延长，直至能看到成像。4、抗体级别不行。对策：更换 EMSA 级别的抗体可解决。5