【资源分享】western blot 常见问题及解决办法

问题   可能原因  验证或解决办法

1 转膜不充分 膜没有完全均匀湿透；   使用100% methanol浸透膜
   靶蛋白分子量小于10,000； 选择小孔径的膜，缩短转移时间
   靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值； 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液
   甲醇浓度过高；   过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替
   转移时间不够Thick gel；  对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间

2 背景高  膜没有完全均匀湿透； 使用100% methanol浸透膜
  洗膜不充分；   增加洗液体积和洗涤次数
  阻断不充分；   增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）
  二抗浓度过高；   降低二抗浓度
  检测过程中膜干燥；   保证充分的反应液，避免出现干膜现象
  曝光过度；    缩短曝光时间
  抗体与阻断蛋白有交叉反应；  检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应

3 没有阳性条带  抗体染色不充分；  增加抗体浓度，延长孵育时间
   酶失活；  直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
   标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低；  设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。
   试剂不匹配；  一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性
   一抗失效；  选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液
   HRP抑制剂；  所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

4 有阳性条带，但条带比较弱  抗体染色不充分；  增加抗体浓度，延长孵育时间
   酶活性降低；  直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
   标本中靶蛋白含量太低；  增加标本上样量。
   洗膜过度；  缩短洗涤时间
   HRP抑制剂；所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
   抗体活性降低；  选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置
   蛋白转移不充分；  见上述
   封闭过度；  减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型
   曝光时间过短；  延长曝光时间
   HRP抑制剂；  所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

5 条带位置（大小）不对；或有非特异性条带 二抗的非特异性结合；  增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）
   一抗的特异性不够；  使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性
   蛋白降解；  使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂
   二聚体或多聚体存在；  增加蛋白质变性过程及强度
   抗体浓度过高；  降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带
   蛋白上样量过大；   降低上样量
6 背景有斑点   封闭剂中有聚集体；  使用前过滤封闭试剂
   HRP耦联二抗中有聚集体；  过滤二抗试剂，去除聚集体
7 膜上出现反像（暗背景上白色带）  HRP含量过高；  降低酶联二抗的浓度