【求助】(Western Blot) 检测不到P-erk却能检测到erk

一抗都是cst的，二抗对照也没有问题，细胞裂解液里有磷酸化酶抑制剂，请问可能是哪里的问题？谢谢。

你说的是正常现象啊。erk细胞内本来就有很多，可以检测到，而p-erk是激活后才有的，有的细胞p-erk是激活的，有的细胞p-erk不是激活的，需要刺激激活。不激活的检测不到。你要是怕实验操作有问题，可以做个用EGF激活的做阳性对照。还有一种情况是，你细胞的erk磷酸化水平低，曝光时间短了，信号没显出来。

（1）即使是正常细胞（没有激活）中，也是可以检测到P-ERK的。如果没有检测到肯定是你的方法的问题。另外你说能检测到ERK，那么其条带清楚吗？如果ERK的条带不是太清楚，或者是中等强度的话，那P-ERK肯定检测不到。正常情况下的ERK条带应该是很浓很浓的才对。

（2）加大蛋白上样量试试，先增加一倍试试看。

（3）加大一抗和二抗的剂量，增大一倍试试。

（4）你的ECL显色剂质量怎样？一定要选好的ECL显色剂，这样即使条带信号弱也可以检测出来。不同厂家的质量差别很大！

请教各位高手用磷酸化抗体检测p-ERK怎么选择不同磷酸化位点的抗体？用H2O2刺激细胞，是选择酪氨酸激活的还是丝氨酸激活的p-ERK？公司提供的目录上有202、204等位点磷酸化的，不知道怎么选。谢谢大家的指导！

Erk活化需要多个位点的同时磷酸化才能够实现，而且活化过程中磷酸化有一个先后的顺序，很复杂。一般认为，Phosphorylation at both the Threonine 202 and Tyrosine 204 residues of ERK1 and Threonine 185 and Tyrosine 187 residues of ERK2 is required for full enzymatic activation.有专门针对这202/204两个位点磷酸化的抗体（不知道说清楚没，就是这两个位点都被磷酸化以后才能被抗体识别），你可以找一下。用这样的抗体最好。另外，单单是磷酸化其实还是不能说明Erk活化的程度。可以考虑用Erk活化程度检测试剂盒，好像cell signaling有，你看一下，能最直接的说明Erk活化的程度。