western blot 检测蛋白激酶磷酸化水平

蛋白质磷酸化属于蛋白质翻译后修饰，是细胞信号转导过程中常见的一种修饰方式，常常用来调节蛋白的活性、构象和相互作用等生物学功能。真核生物中常见的磷酸化发生于丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和组氨酸残基上。

研究蛋白的磷酸化状态对于理解细胞生物学过程具有重要意义。检测蛋白质磷酸化水平的方法有蛋白质免疫印迹（Western blotting）ELISA 酶联免疫反应、细胞免疫化学（ICC）、流式细胞术和磷酸化抗体芯片等，其中最简便的方法是 Western blottind。

蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测蛋白质磷酸化水平需要制备蛋白样品、分离蛋白质、转移蛋白质到膜上，不同于蛋白水平检测的是，最后必须使用对应蛋白磷酸化位点的特异性磷酸化抗体检测蛋白质的磷酸化水平。

实验组和对照组细胞、RIPA 裂解液

蛋白酶/磷酸酶抑制剂 coctail、1×PBS

磷酸化 AKT 抗体（p-AKT)(CST）

5×loading buffer、牛血清白蛋白 BSA

高速预冷离心机、WB 所需仪器

以蛋白激酶 B（PKB），即 Akt 为例，通过 wb 检测蛋白激酶的磷酸化水平如下所示：

1、细胞预处理：实验前一天晚上更换完全培基为无血清培基 8 小时，提取蛋白前再更换为完全培基刺激 20 分钟，饥饿细胞再用血清刺激细胞有利于蛋白激酶磷酸化的检测。

2、提取蛋白：实验组和对照组细胞用冰 PBS 洗 1~2 遍，再用加蛋白酶/磷酸酶抑制剂 coctail 的 RIPA 裂解液在冰上裂解细胞 30 分钟，收集细胞裂解液，超声（可选），4 度 12000 g 离心 8 分钟，取上清。

3、蛋白电泳：变性蛋白，上样，电泳，转膜。提取的蛋白样品短期内用完（2~3 周），凝胶系统试剂现配现用，电泳及转膜条件视目标蛋白大小而定。

4、封闭：检测蛋白质磷酸化时，封闭用 5% BSA 的效果优于脱脂牛奶，封闭 1~2 小时。

5、孵育一抗：这里以检测 p-AKT 为例，AKT 分子量为 60 KD，孵育 p-AKT 抗体 4 °C 过夜。

6、孵育二抗，显影。

1. 样本准备过程中，细胞会释放蛋白酶和去磷酸化酶，为了减少这些酶的活性，处理样本的过程应在冰上进行，并且用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液。

2. 磷酸化特异性抗体的选择：选择磷酸化特异性抗体时，选择所要检测位点的磷酸化抗体至关重要。如果一个激酶具有多个磷酸化位点，那么应该同时检测所有磷酸化位点的磷酸化水平。

3. 转印膜的选择：由于 PVDF 具有比硝酸纤维素更高的结合能力，因此优先选用 PVDF 膜。

4. 洗涤：选用 TBST 洗涤条带要比 PBS 洗涤效果好。

5. 封闭液和抗体稀释液推荐选用 5% 的 BSA 溶液。不推荐用脱脂牛奶，因为牛奶中的酪蛋白会干扰蛋白的磷酸化水平。

1, 显影条带什么也没有。

排除电泳、转膜、一抗二抗属性、一抗二抗以及显影液效价的问题以后，最可能的情况是实验样品本身的磷酸化水平没有激发出来，需要重新制备样品。最好先饥饿细胞几个小时，再用血清刺激几十分钟，一定要加足够量蛋白酶和磷酸酶抑制剂提取蛋白。另外，需要同时 WB 检测总蛋白含量，以排除磷酸化蛋白抽提效率对结果的影响。