材料与仪器
测序级膜蛋白酶
二硫苏糖醇 碘代乙酰胺 乙酸溶液 甲酸 乙酰氯
螯合琼脂糖凝胶层析介质
二硫苏糖醇 碘代乙酰胺 乙酸溶液 甲酸 乙酰氯
螯合琼脂糖凝胶层析介质
步骤
这里所述的方法概括为下列几个步骤：胰蛋白酶水解消化膜和可溶性组分中的蛋白质（见 24. 3.1 )；固相金属螯合亲和层析（IMAC) 富集磷酸肽（见 24. 3. 2 )；用串联质谱对磷酸肽进行鉴定和测序（见 24. 3. 3 )；使用稳定同位素标记的磷酸肽的相对定量分析（见 24.3.4 )；用液相色谱-质谱（LC- MS) 确定蛋白磷酸化率（见 24.3. 5 ) 。
3.1 细胞亚组分的胰蛋白酶消化酶解
1. 膜组分的胰蛋白酶消化酶解
膜表面结合肽的分离：
( 1 ) 用含 10 mmol/L NaF ( 见注释 2 ) 的 25 mmol/L NH4HCO3 ( 见注释 1 ) 溶液清洗分离出来的膜制备物两次。
( 2 ) 用含 10 mmol/L NaF 的 25 mmol/L NH4HCO3 悬浮膜制备物，得到总蛋白浓度为 10~15 mg/ml ( 或者光合膜的叶绿素浓度为 2~3 mg/ml) 。
( 3 ) 在膜悬液中加入 DTT 至终浓度为 1 mmol/L，加碘代乙酰胺至终浓度为 3 mmol/L，还原和烷基化半胱氨酸残基（见注释 3) 。
( 4 ) 用测序级胰蛋白酶 [ 5 μg 胰蛋白酶/mg 叶绿素，或 1 μg 胰蛋白酶/mg 蛋白（见注释 4)]，22°C 消化酶解膜悬液 3 h ( 见注释 5)。
( 5 ) 冻、融消化酶解物，15000 g 或更高转速离心 20 min。
含有膜中释放出来的肽段的上清液可直接用来质谱分析，或通过 IMAC 富集磷酸肽。
2. 可溶性组分的胰蛋白酶消化酶解
( 1 ) 用含 10 mmol/L NaF 的 25 mmol/L NH4HCO3 悬浮蛋白质，蛋白质终浓度为 1~10 mg/ml。
( 2 ) 在悬液中加入 DTT 至终浓度为 1 mmol/L，加碘代乙酰胺至终浓度为 3 mmol/L，还原和烷基化半胱氨酸残基。
( 3 ) 用测序级胰蛋白酶在 37°C 消化 24 h。酶的添加量应为蛋白质总量的 1%~3% ( 通常 100 μg 蛋白质加 2 μg 胰蛋白酶)。
3.2 用固相金属螯合亲和层析法富集磷酸肽
富集的磷酸肽有助于之后对其进行质谱鉴定和测序。由于带负电荷的含磷基团与 Fe (III) 结合，磷酸肽的富集可在固相金属螯合亲和层析柱中经过亲和层析富集。酸性条件下（MeOH/HCl）自由羧基酯化会掩饰负责非特异性结合所有酸性肽的羧基基团的负电荷，因此，酯化，尤其是甲基化能增加磷酸肽的特异性富集 [12] 。
1. 胰蛋白酶酶解多肽的甲基化
( 1 ) 真空离心干燥从 300 μg 蛋白质样品中（或 50 μg 光合膜叶绿素）获得的胰蛋白酶消化肽。
( 2 ) 在 500 μl 甲醇溶液中不断搅拌滴加 80 μl 乙酰氯，配制 2 mol/L 盐酸甲醇溶液。滴加 300 μl 2 mol/L 盐酸甲醇溶液到被真空离心干燥的肽样品中。室温下温浴 2 h 进行酯化反应。
( 3 ) 真空离心干燥酯化了的肽。
2. IMAC
( 1 ) 将 8 μl 螯合琼脂糖凝胶（Chelating Sepharose Fast Flow ( Amersham) ) 珠子悬浮液填装到 GELoader 枪头，制作微型柱。
( 2 ) 用 20 μl 0.1% ( V/V）乙酸冲洗柱子两次，并用 100 μl 0.1 mol/L FeCl3 为柱子挂上电荷（见注释 6) 。
( 3 ) 用 20 μl 0.1% ( V/V ) 乙酸冲洗柱子将未结合的 FeCl3 冲洗掉。
( 4 ) 将甲基化的胰蛋白酶消化肽样品溶解在 5 μl 甲醇/水/乙腈（1 : 1 : 1 ，V/V )中，将溶液加载到柱子上，孵 育 15 min。
( 5 ) 用 20 μl 0.1% (V/V) 乙酸冲洗柱子两次。
( 6 ) 用 20 μl 0.1% ( V/V) 乙酸，20% 乙腈水溶液冲洗柱子两次。
( 7 ) 用 20 μl 20% 乙腈水溶液（V/V ) 冲洗柱子两次。
( 8 ) 用 40 μl 20 mmol/L Na2HPO4，20% 乙腈水溶液洗脱磷酸肽。
通过 IMAC 富集的磷酸肽可以直接在 LC-MS 上分析。但是，如果不经过预先的液相色谱（LC ) 分离，而直接进行电喷雾质谱（ESI- MS) 分析的话，磷酸肽要先用 ZipTiPC18 ( Millipore公司）柱子进行脱盐处理。
3. 用 ZipTipC18 对磷酸肽脱盐处理
( 1 ) 将从 IMAC 洗脱下来的肽样品经真空离心干燥，去除乙腈，用 10 μl 0.1% TFA 水溶液溶解干燥的肽样品。
( 2 ) 用 10 μl 移液器吸取 50% 的乙腈水溶液润湿 ZipTipC18 柱子，反复润湿 3 次。
( 3 ) 用移液器吸取 0.1% TFA 水溶液平衡 ZipTip 柱子，反复平衡 3 次。
( 4 ) 吸取肽样品加到 ZipTip 柱子上，让肽样品结合到柱子上，重复加样 10 次，使肽样品最大程度地结合在柱子上。
( 5 ) 用 0.1% TFA 水溶液清洗 ZipTip 柱子。重复冲洗 5 次。
( 6 ) 用 10 μl 50% 的乙腈水溶液将脱盐的肽样品洗脱到一只干净的试管中（见注释 7)。反复洗脱 10 个循环。
3.3 用电喷雾质谱进行磷酸肽测序
( 1 ) 质谱分析是在一个配备了纳升电离源的混合（四极杆-时间飞行）串联质谱仪上进行的。
( 2 ) 将 2 μl 经过 ZipTips 柱子，用 50% 乙腈水溶液和 1% 甲酸（见注释 8 ) 脱盐的 肽样品上样到纳升电喷雾毛细管（见 24.3.2 节 2) 。
( 3 ) 先记录阳离子模式完全扫描谱。
( 4 ) 这个扫描谱上显示出的每个肽离子（见注释 9 ) 是受到碰撞诱导解离产生的。
( 5 ) 裂解谱通过检测磷酸中性丢失特征信号，鉴定磷酸肽以及确定磷酸化残基。在碰撞引发裂解后，磷酰基团和一个肽之间形成的磷酯键较肽键不稳定，导致带正电荷的含磷酸化残基的肽离子发生磷酸 H3PO4 ( 98Da) 中性丢失 [ 7，13]。磷酸中性丢失发生在选择母离子和含有磷酸化残基的碎片离子上。
( 6 ) 质谱图要对以下片段的谱值进行验证：含磷酰基（含磷酸化残基的肽段增加了 80 Da ) 的 Y ( C 端）和 B ( N 端）碎片离子和发生 98 Da 中性丢失的卫星碎片离子（丢失磷酸的肽段) 。
( 7 ) 同时，质谱图还要对从不含磷酸化残基的肽段发出的互补离子信号进行验证，对每个频谱的解释可以完成包括磷酸化位点的肽序列分析工作（甚至从头测序工作) 。
( 8 ) 肽的鉴定也可以通过把实验中得到的裂解片段谱图提交到一个使用 Mascot 服务器的数据库中进行检索（ http: //www. matrixscience.com/) 。设置 Mascot MS/MS 离子检索程序可以让肽的甲基化和磷酸化包括在检索范围内。
3.4 磷酸化肽的相对定量
肽的性质及其电离特性决定用质谱检测的肽离子强度。因此，不同肽段的定量比较 是不可能的。但是，质谱检测结合稳定同位素标记技术可以用来对两个完全不同的蛋白 质样品进行蛋白磷酸化的相对定量分析。这种实验的路线图见图 24-1A。通过盐酸甲醇 酯化同时标记两个等量肽样品，它们是在不同条件下生长的植物的同一组织或细胞组分中获得蛋白质的胰蛋白酶消化酶解产物，用甲醇-d3 标记一个样本，甲醇-d3 标记另一个样本，分别生成轻、重标记的两个肽段 [ 14，15 ] 。合并这两个样品，运行 IMAC 获得富含磷酸肽组分。质谱检测获得轻、重同位素标记肽（图 24-1B 和 C) 比例的结果。轻、重同位素标记的肽段的峰面积总和的比值与不同条件下的蛋白质特定位点的磷酸化的差异相关。
( 1 ) 真空离心干燥胰蛋白酶酶解肽段样品，它是生长在两个不同条件下的植物的相同细胞组分的 150 μg 蛋白质的胰蛋白酶酶解产物。
( 2 ) 边搅拌，边滴加 80 μl 乙酰氯到 500 μl 甲醇 - d0 或者 500 μl 氘代甲醇- d3，制备 2 mol/L 盐酸甲醇轻、重标记溶液。加入 200 μl 2 mol/L 盐酸甲醇-d0 到干燥肽样品 1 中，加入 200 μl 盐酸氘代甲醇-d3 到干燥的肽样品 2 中。室温下温育混合物 2 h，进行酿化反应。
( 3 ) 混合样品 1 和样品 2，真空离心干燥。
( 4 ) 用 5 μl 甲醇/水/乙腈（1 : 1 : 1，体积比）溶解干燥的肽样品，运行上述的 IMAC ( 见 24.3.2 节 2 ) 。
为建立内标，需要添加一个额外的实验。在这个实验中，两个样品分别被以相反的 形式标记，如样品 1 被轻同位素标记，则样品 2 就被重同位素标记。接着用重甲醇甲基化样品 1，用轻甲醇甲基化样品 2。与内标对比后， “ 直接”标记（图 24-1B ) 和 “ 反向”标记（图 24-1C) 的质谱图显示相同的磷酸化比例。
3.5 用 LC-MS 测定蛋白质的磷酸化比率
在为从膜中或可溶性（见 24. 3.1 节 2 ) 细胞组分中获得的肽混合物中的磷酸肽进行质谱分析后（见 24.3.1 节 1) ，每个初始位点的磷酸化的化学计量可通过 LC- MS 确定。该方法是基于测量在混合物中磷酸化肽与非磷酸化肽的比例（见注释 10)。
( 1 ) 在这个实验中，取 20~40 μl 经胰蛋白酶消化的总肽混合物（见 24.3.1 节 1 和 24.3.1 节 2 ) 作为 LC-MS 分析的样品。用 5 μm 的 C18 MetaChem 150 mmX1.0 mm 柱子以流速 20 μl/min，分离肽样品组分。
( 2 ) 用 0.1% ( V/V ) 的甲酸水溶液（A ) 和 0.1%（V/V) 的甲酸乙腈溶液（B) ，按如下时间段用于洗脱：0% B，0~3 min；0~20% B，3~20 min；20%~70% B，20~105 min：70%~99% B，105~115 min。
( 3 ) 用带标准离子喷雾源的三重四极杆质谱仪进行肽段在线检测。采用该设备推荐的设置。
( 4 ) 在整个 LC-MS 运行过程中连续进行两个平行的质谱分析：① 在正电离模式下，获取所有的肽组分频谱；② 在检测 m/z=-79 的诊断磷离子的负电离模式下，检测含磷酸肽的组分（见注释 11)。
( 5 ) 两个平行实验的结果（图 24-2A 和 B ) 被存储为电计算机文档，如图 24-2 所示对它们进行分析。
( 6 ) 首先，要确定已知 m/z 的磷酸肽的洗脱收集点。
( 7 ) 然后确定那些与非磷酸化肽对应的洗脱峰信号。
( 8 ) 每个磷酸肽所有电离状态的峰值强度总和与相对应的非磷酸化肽段的所有电离状态的峰值强度总和的比值，反映了蛋白质的磷酸化程度。
( 9 ) 因为同时在同一样品中被检测到磷酸化肽和非磷酸化肽，因此来自膜或可溶性组分的样品中的具体蛋白质的磷酸化化学计量可被测量。
3.1 细胞亚组分的胰蛋白酶消化酶解
1. 膜组分的胰蛋白酶消化酶解
膜表面结合肽的分离：
( 1 ) 用含 10 mmol/L NaF ( 见注释 2 ) 的 25 mmol/L NH4HCO3 ( 见注释 1 ) 溶液清洗分离出来的膜制备物两次。
( 2 ) 用含 10 mmol/L NaF 的 25 mmol/L NH4HCO3 悬浮膜制备物，得到总蛋白浓度为 10~15 mg/ml ( 或者光合膜的叶绿素浓度为 2~3 mg/ml) 。
( 3 ) 在膜悬液中加入 DTT 至终浓度为 1 mmol/L，加碘代乙酰胺至终浓度为 3 mmol/L，还原和烷基化半胱氨酸残基（见注释 3) 。
( 4 ) 用测序级胰蛋白酶 [ 5 μg 胰蛋白酶/mg 叶绿素，或 1 μg 胰蛋白酶/mg 蛋白（见注释 4)]，22°C 消化酶解膜悬液 3 h ( 见注释 5)。
( 5 ) 冻、融消化酶解物，15000 g 或更高转速离心 20 min。
含有膜中释放出来的肽段的上清液可直接用来质谱分析，或通过 IMAC 富集磷酸肽。
2. 可溶性组分的胰蛋白酶消化酶解
( 1 ) 用含 10 mmol/L NaF 的 25 mmol/L NH4HCO3 悬浮蛋白质，蛋白质终浓度为 1~10 mg/ml。
( 2 ) 在悬液中加入 DTT 至终浓度为 1 mmol/L，加碘代乙酰胺至终浓度为 3 mmol/L，还原和烷基化半胱氨酸残基。
( 3 ) 用测序级胰蛋白酶在 37°C 消化 24 h。酶的添加量应为蛋白质总量的 1%~3% ( 通常 100 μg 蛋白质加 2 μg 胰蛋白酶)。
3.2 用固相金属螯合亲和层析法富集磷酸肽
富集的磷酸肽有助于之后对其进行质谱鉴定和测序。由于带负电荷的含磷基团与 Fe (III) 结合，磷酸肽的富集可在固相金属螯合亲和层析柱中经过亲和层析富集。酸性条件下（MeOH/HCl）自由羧基酯化会掩饰负责非特异性结合所有酸性肽的羧基基团的负电荷，因此，酯化，尤其是甲基化能增加磷酸肽的特异性富集 [12] 。
1. 胰蛋白酶酶解多肽的甲基化
( 1 ) 真空离心干燥从 300 μg 蛋白质样品中（或 50 μg 光合膜叶绿素）获得的胰蛋白酶消化肽。
( 2 ) 在 500 μl 甲醇溶液中不断搅拌滴加 80 μl 乙酰氯，配制 2 mol/L 盐酸甲醇溶液。滴加 300 μl 2 mol/L 盐酸甲醇溶液到被真空离心干燥的肽样品中。室温下温浴 2 h 进行酯化反应。
( 3 ) 真空离心干燥酯化了的肽。
2. IMAC
( 1 ) 将 8 μl 螯合琼脂糖凝胶（Chelating Sepharose Fast Flow ( Amersham) ) 珠子悬浮液填装到 GELoader 枪头，制作微型柱。
( 2 ) 用 20 μl 0.1% ( V/V）乙酸冲洗柱子两次，并用 100 μl 0.1 mol/L FeCl3 为柱子挂上电荷（见注释 6) 。
( 3 ) 用 20 μl 0.1% ( V/V ) 乙酸冲洗柱子将未结合的 FeCl3 冲洗掉。
( 4 ) 将甲基化的胰蛋白酶消化肽样品溶解在 5 μl 甲醇/水/乙腈（1 : 1 : 1 ，V/V )中，将溶液加载到柱子上，孵 育 15 min。
( 5 ) 用 20 μl 0.1% (V/V) 乙酸冲洗柱子两次。
( 6 ) 用 20 μl 0.1% ( V/V) 乙酸，20% 乙腈水溶液冲洗柱子两次。
( 7 ) 用 20 μl 20% 乙腈水溶液（V/V ) 冲洗柱子两次。
( 8 ) 用 40 μl 20 mmol/L Na2HPO4，20% 乙腈水溶液洗脱磷酸肽。
通过 IMAC 富集的磷酸肽可以直接在 LC-MS 上分析。但是，如果不经过预先的液相色谱（LC ) 分离，而直接进行电喷雾质谱（ESI- MS) 分析的话，磷酸肽要先用 ZipTiPC18 ( Millipore公司）柱子进行脱盐处理。
3. 用 ZipTipC18 对磷酸肽脱盐处理
( 1 ) 将从 IMAC 洗脱下来的肽样品经真空离心干燥，去除乙腈，用 10 μl 0.1% TFA 水溶液溶解干燥的肽样品。
( 2 ) 用 10 μl 移液器吸取 50% 的乙腈水溶液润湿 ZipTipC18 柱子，反复润湿 3 次。
( 3 ) 用移液器吸取 0.1% TFA 水溶液平衡 ZipTip 柱子，反复平衡 3 次。
( 4 ) 吸取肽样品加到 ZipTip 柱子上，让肽样品结合到柱子上，重复加样 10 次，使肽样品最大程度地结合在柱子上。
( 5 ) 用 0.1% TFA 水溶液清洗 ZipTip 柱子。重复冲洗 5 次。
( 6 ) 用 10 μl 50% 的乙腈水溶液将脱盐的肽样品洗脱到一只干净的试管中（见注释 7)。反复洗脱 10 个循环。
3.3 用电喷雾质谱进行磷酸肽测序
( 1 ) 质谱分析是在一个配备了纳升电离源的混合（四极杆-时间飞行）串联质谱仪上进行的。
( 2 ) 将 2 μl 经过 ZipTips 柱子，用 50% 乙腈水溶液和 1% 甲酸（见注释 8 ) 脱盐的 肽样品上样到纳升电喷雾毛细管（见 24.3.2 节 2) 。
( 3 ) 先记录阳离子模式完全扫描谱。
( 4 ) 这个扫描谱上显示出的每个肽离子（见注释 9 ) 是受到碰撞诱导解离产生的。
( 5 ) 裂解谱通过检测磷酸中性丢失特征信号，鉴定磷酸肽以及确定磷酸化残基。在碰撞引发裂解后，磷酰基团和一个肽之间形成的磷酯键较肽键不稳定，导致带正电荷的含磷酸化残基的肽离子发生磷酸 H3PO4 ( 98Da) 中性丢失 [ 7，13]。磷酸中性丢失发生在选择母离子和含有磷酸化残基的碎片离子上。
( 6 ) 质谱图要对以下片段的谱值进行验证：含磷酰基（含磷酸化残基的肽段增加了 80 Da ) 的 Y ( C 端）和 B ( N 端）碎片离子和发生 98 Da 中性丢失的卫星碎片离子（丢失磷酸的肽段) 。
( 7 ) 同时，质谱图还要对从不含磷酸化残基的肽段发出的互补离子信号进行验证，对每个频谱的解释可以完成包括磷酸化位点的肽序列分析工作（甚至从头测序工作) 。
( 8 ) 肽的鉴定也可以通过把实验中得到的裂解片段谱图提交到一个使用 Mascot 服务器的数据库中进行检索（ http: //www. matrixscience.com/) 。设置 Mascot MS/MS 离子检索程序可以让肽的甲基化和磷酸化包括在检索范围内。
3.4 磷酸化肽的相对定量
肽的性质及其电离特性决定用质谱检测的肽离子强度。因此，不同肽段的定量比较 是不可能的。但是，质谱检测结合稳定同位素标记技术可以用来对两个完全不同的蛋白 质样品进行蛋白磷酸化的相对定量分析。这种实验的路线图见图 24-1A。通过盐酸甲醇 酯化同时标记两个等量肽样品，它们是在不同条件下生长的植物的同一组织或细胞组分中获得蛋白质的胰蛋白酶消化酶解产物，用甲醇-d3 标记一个样本，甲醇-d3 标记另一个样本，分别生成轻、重标记的两个肽段 [ 14，15 ] 。合并这两个样品，运行 IMAC 获得富含磷酸肽组分。质谱检测获得轻、重同位素标记肽（图 24-1B 和 C) 比例的结果。轻、重同位素标记的肽段的峰面积总和的比值与不同条件下的蛋白质特定位点的磷酸化的差异相关。
( 1 ) 真空离心干燥胰蛋白酶酶解肽段样品，它是生长在两个不同条件下的植物的相同细胞组分的 150 μg 蛋白质的胰蛋白酶酶解产物。
( 2 ) 边搅拌，边滴加 80 μl 乙酰氯到 500 μl 甲醇 - d0 或者 500 μl 氘代甲醇- d3，制备 2 mol/L 盐酸甲醇轻、重标记溶液。加入 200 μl 2 mol/L 盐酸甲醇-d0 到干燥肽样品 1 中，加入 200 μl 盐酸氘代甲醇-d3 到干燥的肽样品 2 中。室温下温育混合物 2 h，进行酿化反应。
( 3 ) 混合样品 1 和样品 2，真空离心干燥。
( 4 ) 用 5 μl 甲醇/水/乙腈（1 : 1 : 1，体积比）溶解干燥的肽样品，运行上述的 IMAC ( 见 24.3.2 节 2 ) 。
为建立内标，需要添加一个额外的实验。在这个实验中，两个样品分别被以相反的 形式标记，如样品 1 被轻同位素标记，则样品 2 就被重同位素标记。接着用重甲醇甲基化样品 1，用轻甲醇甲基化样品 2。与内标对比后， “ 直接”标记（图 24-1B ) 和 “ 反向”标记（图 24-1C) 的质谱图显示相同的磷酸化比例。
3.5 用 LC-MS 测定蛋白质的磷酸化比率
在为从膜中或可溶性（见 24. 3.1 节 2 ) 细胞组分中获得的肽混合物中的磷酸肽进行质谱分析后（见 24.3.1 节 1) ，每个初始位点的磷酸化的化学计量可通过 LC- MS 确定。该方法是基于测量在混合物中磷酸化肽与非磷酸化肽的比例（见注释 10)。
( 1 ) 在这个实验中，取 20~40 μl 经胰蛋白酶消化的总肽混合物（见 24.3.1 节 1 和 24.3.1 节 2 ) 作为 LC-MS 分析的样品。用 5 μm 的 C18 MetaChem 150 mmX1.0 mm 柱子以流速 20 μl/min，分离肽样品组分。
( 2 ) 用 0.1% ( V/V ) 的甲酸水溶液（A ) 和 0.1%（V/V) 的甲酸乙腈溶液（B) ，按如下时间段用于洗脱：0% B，0~3 min；0~20% B，3~20 min；20%~70% B，20~105 min：70%~99% B，105~115 min。
( 3 ) 用带标准离子喷雾源的三重四极杆质谱仪进行肽段在线检测。采用该设备推荐的设置。
( 4 ) 在整个 LC-MS 运行过程中连续进行两个平行的质谱分析：① 在正电离模式下，获取所有的肽组分频谱；② 在检测 m/z=-79 的诊断磷离子的负电离模式下，检测含磷酸肽的组分（见注释 11)。
( 5 ) 两个平行实验的结果（图 24-2A 和 B ) 被存储为电计算机文档，如图 24-2 所示对它们进行分析。
( 6 ) 首先，要确定已知 m/z 的磷酸肽的洗脱收集点。
( 7 ) 然后确定那些与非磷酸化肽对应的洗脱峰信号。
( 8 ) 每个磷酸肽所有电离状态的峰值强度总和与相对应的非磷酸化肽段的所有电离状态的峰值强度总和的比值，反映了蛋白质的磷酸化程度。
( 9 ) 因为同时在同一样品中被检测到磷酸化肽和非磷酸化肽，因此来自膜或可溶性组分的样品中的具体蛋白质的磷酸化化学计量可被测量。
来源：丁香实验
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