【求助】磷酸化蛋白鉴定 蛋白提取 磷酸酶
丁香园论坛
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各位大侠好，
我是外科学的医学生，现在在实验，提的问题很弱智，大家勿拍。
我做目的蛋白的western, 发现其在处理组有明显的分子量漂移，初步推测其为磷酸化改变---因为再同时加了一种激酶的抑制剂后，这种漂移消失了。
但问题是，怎么证明它确实是磷酸化呢？
我查了查文献，目前常用的是放射性P实验和质谱分析什么的，但这对于我们的条件和经费来说，似乎不太可能。
我的问题：
1. 是否可以在用RIPA裂解液提总蛋白时，加入蛋白磷酸酶（大多需要37度孵育？？），然后再western，观察其漂移是否消失？
磷酸酶37度孵育才有用，蛋白酶抑制剂多加些可以吗？
2. 用蛋白质组学里的二维电泳呢？
二维电泳后的胶可以像western那样转膜，显影吗？ 我看到文献里好像都是直接染胶了呀。。。
我是外科学的医学生，现在在实验，提的问题很弱智，大家勿拍。
我做目的蛋白的western, 发现其在处理组有明显的分子量漂移，初步推测其为磷酸化改变---因为再同时加了一种激酶的抑制剂后，这种漂移消失了。
但问题是，怎么证明它确实是磷酸化呢？
我查了查文献，目前常用的是放射性P实验和质谱分析什么的，但这对于我们的条件和经费来说，似乎不太可能。
我的问题：
1. 是否可以在用RIPA裂解液提总蛋白时，加入蛋白磷酸酶（大多需要37度孵育？？），然后再western，观察其漂移是否消失？
磷酸酶37度孵育才有用，蛋白酶抑制剂多加些可以吗？
2. 用蛋白质组学里的二维电泳呢？
二维电泳后的胶可以像western那样转膜，显影吗？ 我看到文献里好像都是直接染胶了呀。。。
楼主为什么不考虑采用磷酸化的抗体呢？
比如，对于目的基因A可以先分别用anti-A和anti-p-A的一抗进行western，然后再用相应的抑制剂进行处理后，再用anti-A和anti-p-A的一抗进行western， 如果此时anti-p-A的一抗的条带变暗了，那就说明是磷酸化的问题~
所以在楼主用那些比较麻烦的事情之前，可以先尝试一下我说的方法~
比如，对于目的基因A可以先分别用anti-A和anti-p-A的一抗进行western，然后再用相应的抑制剂进行处理后，再用anti-A和anti-p-A的一抗进行western， 如果此时anti-p-A的一抗的条带变暗了，那就说明是磷酸化的问题~
所以在楼主用那些比较麻烦的事情之前，可以先尝试一下我说的方法~
谢谢回答。只是目前没有商业化的磷酸化抗体呀。。。
可以用蛋白磷酸化水平检测试剂盒 BSP061
Phosphoprotein PhosphateEstimation Kit
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