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磷酸化蛋白鉴定

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2436
1. 前言

鉴定植物磷酸化蛋白质的实验方法主要有以下 5 种 :① 放射性同位素 32P 或 33P 标记 [1];② 不同蛋白质电泳迁移率的检测 [ 2,3] ;③ 磷酰氨基酸特异性抗体的免疫分析[ 3,4];④ 磷酸化诱导增加的完整蛋白质质量的质谱分析[5,6] ;⑤ 蛋白质水解后得到的磷酸肽的鉴定及序列分析 [ 7~9] 。最近已经报道了以上所列的此种技术用于检测植物类囊体膜上磷酸化蛋白的实验方法[ 10] 。因此,本章将不再进一步讨论以上 ①~④ 的实验方法,重点讨论最有效率和最有用的第 ⑤ 种实验方法。

这一技术基于蛋白质组分的胰蛋白酶消化以及肽段(不是蛋白质)的进一步分离,蛋白质的水解消化应该在不同的膜分离制备物或植物细胞可溶性组分中进行。通过固相金属螯合亲和层析(IMAC) 富集得到的肽混合物中的磷酸肽,用串联质谱对分离到的磷酸肽进行序列分析。这种方法能识别体内磷酸化蛋白质及其蛋白质序列磷酸化的准确位点。该方法对最近完成的植物以及其他物种中蛋白质磷酸化位点定位图作出了主要的贡献 [11] 。 这种方法关键部分就是磷酸化肽段的质谱序列分析。一旦蛋白质磷酸化位点被定位,接下来的蛋白质磷酸化程度的相对定量分析可通过以下介绍的实验方法中的两个不同的实 验步骤来完成,在此需要提醒大家的是,这里所介绍的成功应用以质谱为基础的磷酸肽鉴定的方法,仅限于已经完成基因组测序的植物物种的蛋白质磷酸化鉴定和分析。
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