请问，phostag检测蛋白磷酸化，该怎么对磷酸化的蛋白水平进行定量呢？是用磷酸化条带/总蛋白条带，还是用磷酸化条带/非磷酸化条？

都可以，但是实际应用中还是磷酸化/总蛋白条带好一些。

Phos-tag SDS-PAGE检测蛋白磷酸化，可使用常规SDS-PAGE程序分离磷酸化和非磷酸化蛋白质。可使用常规SDS-PAGE程序分离磷酸化和非磷酸化蛋白质。该技术使用分离凝胶，其中丙烯酰胺与作为磷酸捕获分子的Phos-tag Acrylamide共聚。试剂、蛋白质样品制备和电泳操作与常规SDS-PAGE程序相似。由于磷酸化蛋白质在电泳过程中与固定在凝胶中的Phos-tag表现出可逆结合，因此它们的迁移速度比非磷酸化蛋白质的迁移速度更慢，从而导致磷酸化蛋白质的迁移率存在可检测的差异。

这种电泳技术允许分离含有相同数量磷酸基团的磷酸化蛋白质，但在分子内的不同位置会产生不同的迁移带。因此，可以将单一蛋白质的多种磷酸化形式检测为凝胶上的多个迁移带。此外，Phos-tag SDS-PAGE不仅可以分析Ser-、Thr-和 Tyr-磷酸化蛋白，还可以分析参与双组分信号系统的不稳定His-和 Asp-磷酸化蛋白。因此，该技术适用于对具有不同磷酸化状态的蛋白质进行定量和定性分析。

Phos-tag技术可以用于检测蛋白磷酸化，但是该技术无法进行磷酸化的蛋白水平定量，因为Phos-tag技术检测的是蛋白磷酸化的存在与否，而不是磷酸化的程度。因此，通常需要用其他定量方法，例如Western blotting和ELISA等来定量磷酸化蛋白的水平。对于Western blotting方法，可以使用磷酸化条带/总蛋白条带的比值来评估磷酸化蛋白的水平，但是该方法仅限于相对定量。如果需要进行绝对定量，则需要使用标准曲线等方法。