WB怎样用非磷酸化抗体识别磷酸化蛋白？WB求教
丁香园论坛
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非磷酸化抗体是识别总得蛋白的，比如AKT。
P-AKT和AKT其实只差一些磷酸基，分子量稍大点，以前听别人讲P-AKT和AKT之间有shift，有时候WB是可以做出来的。
用的是梯度胶？分子量在68KD左右。应该怎么样来配胶呢？梯度胶的浓度？
谢谢！
P-AKT和AKT其实只差一些磷酸基，分子量稍大点，以前听别人讲P-AKT和AKT之间有shift，有时候WB是可以做出来的。
用的是梯度胶？分子量在68KD左右。应该怎么样来配胶呢？梯度胶的浓度？
谢谢！
希望高手能赐教！
某些 AKT抗体，如cell signaling, #9272, 不能识别磷酸化AKT，只能识别非磷酸化AKT。
所以，最好用磷酸化抗体来做。
所以，最好用磷酸化抗体来做。
非磷酸化的多克隆抗体（比如兔多抗）一般是可以识别磷酸化蛋白的，但是通常磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的分子量没有什么区别，所以做出的带子通常是非磷酸化和磷酸化蛋白叠加的带子，而且磷酸化蛋白只占非磷酸化蛋白的很小很小一部分，我们就认为那是由非磷酸化蛋白组成的。要想检测磷酸化蛋白，两种方法：特异的磷酸化抗体检测；采用免疫沉淀的方法先用非磷酸化抗体沉淀，再用磷酸化丝氨酸或酪氨酸抗体检测其中磷酸化的蛋白部分。这样就没有问题了。
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