【转帖】llllcjchina做磷酸化蛋白wb的经验
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1.一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。
2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4度也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。
3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cell signaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体。
3.最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。如Cell signaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST。
4.抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。
5.研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完phospho-p38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标actin。
6.做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的band以外,往往会出现非特异性的band.磷酸化抗体不好的话,甚至会压出非特异性的band,而没有你想要的band,所以压片以后,你一定要根据markers比对一下,你压出的band分子量是否正确.我以前压WB时,压出了一条band,就以为是我想要的那条,然后还根据趋势推测可能的机制,走了不少怨枉路.还有一次,把markers的分子量记错了,比对出来的结果当然也不对.
7.磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则backgroud太深盖住想要的那条band,时间过短则可能没有band或者band太浅.
8.磷酸化蛋白WB时,用TBST洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快,洗的时间不要太长,孵育一抗和二抗之后分别洗5min 3次即可,宁愿background深一些,总比做不出来强得多.另外，洗的时候，最好不要把几张membrane叠在一起洗。
9.附件中表格列出的是我所用的做磷酸化蛋白western blot的lysis buffer的配方,效果不错,供您参考.
Buffer Stock Working 100ml
MW g/100ml ml
Tris 1.080382.2500(Merck) Powder 121.14 1M 12.114 5
NaCl 31434(Riedel-deHaen) Powder 58.44 5M 29.22 3
NP-40 I-3021(Sigma) Solution 10% 10 10
Sodium deoxycholate D6750(Sigma) Powder 414.6 10% 10 2.5
EDTA.4Na E8145(Sigma) Powder 468.3 0.25M 11.7075 0.4
Protease inhibitors
Aprotenin A6279(Sigma) Solution 10mg/ml 0.1
Leupeptin Powder 10mg/ml 0.1
PMSF Powder 100mM 1
Phosphatase inhibitors
b-glycerophosphate Powder 1M 1
Na3VO4 S6508(Sigma) Powder 183.9 1M 18.39 0.1
NaF 1.06449(Merck) Powder 41.99 0.5M 2.0995 0.2
H2O 78.7
10.对我的lysis buffer配方作以下说明:
(1)Na3VO4要活化
(2)我的配方配的是100ml 细胞裂解液,但如您各个成分的体积加起来,会发现total=102.1ml,那是因为这些成分加在一起后总体积会缩小的.
11.正如我在第5点所说的,"研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量“。这有两种方法，一是：相同的sample在不同的well中上样两次（可在相同的gel上，也可在不同的gel），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个gel，压内标。但是本人不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，本人也建议如此的方法，即：将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去（strip），strip solution如下:
100mM 2-mercaptoethanol (stock 14.335M, 取697.6ul)
2% SDS (stock 10%, 取20ml)
62.5mM Tris (pH6.7)(stock 1M, 取6.25ml)
加水至100ml
然后50度水浴30min.
许多人会建议55度水浴30min。Strip solution是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。我本人经实验发现水浴时有时温度不稳定，温度定为55度时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除，故建议温度设为50度30min，既能有效去除已结合的抗体，又比55度更能保护蛋白.
12. Strip时一定要注意：membrane一定要完全泡在strip solution中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受热均匀。这一点很重要，要不然，随后压出来的总蛋白也好，内标也好就会不均一，无法进行比较。我曾将同一张membrane用我提供的方法strip了3次，分别压不同的抗体（因为有时候蛋白分子量很接近），效果都不错。
13. Activation of Sodium OrthoVanadate
(1). Make Sodium orthovanadate to 200mM in ddH2O.
(2). Adjust pH to 10.0 with 1M NaOH or 1M HCl (the starting pH varies depending on the lot of the chemical). At pH 10.0 the solution is yellow.
(3). Boil the solution until it turns colorless (about 10 mins).
(4). Allow solution to cool to room temperature.
(5). Readjust pH to 10.0 and repeat steps 3 & 4 until the soluition remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. Store in aliquots at -20 oC.
NOTE: Activation depolymerizes the vanadate, converting it to a more potent
inhibitor of protein tyrosine phosphatases. See: Gordon J. Methods Enzymol. 1991, 201:477-82.
2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4度也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。
3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cell signaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体。
3.最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。如Cell signaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST。
4.抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。
5.研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完phospho-p38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标actin。
6.做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的band以外,往往会出现非特异性的band.磷酸化抗体不好的话,甚至会压出非特异性的band,而没有你想要的band,所以压片以后,你一定要根据markers比对一下,你压出的band分子量是否正确.我以前压WB时,压出了一条band,就以为是我想要的那条,然后还根据趋势推测可能的机制,走了不少怨枉路.还有一次,把markers的分子量记错了,比对出来的结果当然也不对.
7.磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则backgroud太深盖住想要的那条band,时间过短则可能没有band或者band太浅.
8.磷酸化蛋白WB时,用TBST洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快,洗的时间不要太长,孵育一抗和二抗之后分别洗5min 3次即可,宁愿background深一些,总比做不出来强得多.另外，洗的时候，最好不要把几张membrane叠在一起洗。
9.附件中表格列出的是我所用的做磷酸化蛋白western blot的lysis buffer的配方,效果不错,供您参考.
Buffer Stock Working 100ml
MW g/100ml ml
Tris 1.080382.2500(Merck) Powder 121.14 1M 12.114 5
NaCl 31434(Riedel-deHaen) Powder 58.44 5M 29.22 3
NP-40 I-3021(Sigma) Solution 10% 10 10
Sodium deoxycholate D6750(Sigma) Powder 414.6 10% 10 2.5
EDTA.4Na E8145(Sigma) Powder 468.3 0.25M 11.7075 0.4
Protease inhibitors
Aprotenin A6279(Sigma) Solution 10mg/ml 0.1
Leupeptin Powder 10mg/ml 0.1
PMSF Powder 100mM 1
Phosphatase inhibitors
b-glycerophosphate Powder 1M 1
Na3VO4 S6508(Sigma) Powder 183.9 1M 18.39 0.1
NaF 1.06449(Merck) Powder 41.99 0.5M 2.0995 0.2
H2O 78.7
10.对我的lysis buffer配方作以下说明:
(1)Na3VO4要活化
(2)我的配方配的是100ml 细胞裂解液,但如您各个成分的体积加起来,会发现total=102.1ml,那是因为这些成分加在一起后总体积会缩小的.
11.正如我在第5点所说的,"研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量“。这有两种方法，一是：相同的sample在不同的well中上样两次（可在相同的gel上，也可在不同的gel），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个gel，压内标。但是本人不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，本人也建议如此的方法，即：将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去（strip），strip solution如下:
100mM 2-mercaptoethanol (stock 14.335M, 取697.6ul)
2% SDS (stock 10%, 取20ml)
62.5mM Tris (pH6.7)(stock 1M, 取6.25ml)
加水至100ml
然后50度水浴30min.
许多人会建议55度水浴30min。Strip solution是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。我本人经实验发现水浴时有时温度不稳定，温度定为55度时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除，故建议温度设为50度30min，既能有效去除已结合的抗体，又比55度更能保护蛋白.
12. Strip时一定要注意：membrane一定要完全泡在strip solution中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受热均匀。这一点很重要，要不然，随后压出来的总蛋白也好，内标也好就会不均一，无法进行比较。我曾将同一张membrane用我提供的方法strip了3次，分别压不同的抗体（因为有时候蛋白分子量很接近），效果都不错。
13. Activation of Sodium OrthoVanadate
(1). Make Sodium orthovanadate to 200mM in ddH2O.
(2). Adjust pH to 10.0 with 1M NaOH or 1M HCl (the starting pH varies depending on the lot of the chemical). At pH 10.0 the solution is yellow.
(3). Boil the solution until it turns colorless (about 10 mins).
(4). Allow solution to cool to room temperature.
(5). Readjust pH to 10.0 and repeat steps 3 & 4 until the soluition remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. Store in aliquots at -20 oC.
NOTE: Activation depolymerizes the vanadate, converting it to a more potent
inhibitor of protein tyrosine phosphatases. See: Gordon J. Methods Enzymol. 1991, 201:477-82.
