去磷酸化的平端或5'凹端DNA分子的磷酸化

在 T4 多核苷酸激酶的正向反应中，带有平端、5' 凹端或分子内切口的 DNA 底物比 5' 突出端的分子标记效率低。

T4 噬菌体多核苷酸激酶
乙酸铵 EDTA 乙醇 咪唑缓冲液 聚乙二醇
液体闪烁计数仪 Sephadex G-50 离心柱 Sephadex G-50 柱

一、方法

1. 缓冲液和溶液

乙酸铵（10 mol/L）

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0）

乙醇

10X 咪唑缓冲液（500 mmol/L 咪唑盐酸（pH 6.4），180 mmol/L MgCl₂，50 mmol/L DTT，1 mmol/L 亚精胺盐酸，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)）

水配制聚乙二醇（24% m/V PEG 8000)

2. 酶和缓冲液

T4 噬菌体多核苷酸激酶

3. 核酸和寡梭苷酸

DNA (10~50 pmol，体积 ≤ 11 μl）

4. 放射性复合物

[γ-³²P] ATP ( 10 mCi/ml，比活性为 3000 Ci/mmol）

5. 专用设备

可通过切仑科夫辐射定量 ³²P 的液体闪烁计数仪

Sephadex G-50 离心柱，用 TE（pH 7.6) 平衡

或

Sephadex G-50 柱（1 ml)，用 TE ( pH 7.6) 平衡

二、方法

1. 在一个微量离心管中，按下列顺序混合：

去磷酸化的 DNA         10~50 pmol

10X 咪唑缓冲液           4 μl

水                              加至 15 μl

24% (m/V) PEG          10 μl

2. 加入 40 pmol [γ-³²P] ATP (10 mCi/ml；比活性为 3000 Ci/mmol)，加水至反应终体积为 40 μl。

3. 在反应中加入 40 单位的 T4 噬菌体多核苷酸激酶。轻弹管壁以混匀试剂，37℃ 温育反应 30 min。

4. 加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 以终止反应。用液体闪烁计数仪的切仑科夫计数检测反应混合物的总放射性活度。

5. 通过以下方法分离放射性标记的探针与未掺入的 dNTP：

用 Sephadex G-50 离心柱层析

或

用 1 ml Sephadex G-50 柱（用 TE 平衡）常规尺寸排阻层析

或

进行两轮乙酸铵和乙醇选择性沉淀放射性标记的 DNA

6. 用切仑科夫计数测量探针的放射性活度。用探针的放射性活度除以反应混合物中的放射性活度总量来计算放射性标记物转移到 5' 端的效率。