平端DNA连接

T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接（Sgaramella和Khorana，1972;Sgaramella和Ehrlich，1978），由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。

优点：

1、没有连不上的，只有切不开的。平末端连接不牵扯到粘性末端的碱基突出问题，所以，理论上任何两条DNA序列都能连接在一起，当然需要ligase的酶学作用。这个不同DNA分子之间的连接带来了极大地便利，因为平末端自然是这样，而如果遇到5‘或者3’突出的粘性末端，也可以经过处理成为平末端。

2、有时候，两个平末端连接在一起以后，可以产生另一种内切酶的识别序列，为后续的克隆工作提供了一种机会。

缺点：

1、连接效率比粘性末端低：连接效率之所以比较低，原因之一是在连接过程中只有连接酶的作用，缺乏粘性末端那样突出碱基的互补作用；原因之二是常用的T4DNAligase对于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。

2、可能产生双向插入：由于平端连接的末端没有特异性，连接的时候不能定向，所以两种方向的插入都有可能。这个时候就需要有一种有效的鉴定方法。一般分别在载体和目的片段选择一个酶切位点进行酶切鉴定，当然，具体的鉴定方法要根据具体的实验而定。

3、可能多拷贝插入：平端连接时，可能目的片段多个插入，并且在多个插入的时候还有可能每个插入子以不同方向连接，导致有时候结果难以解释。一般目的片段越大，多拷贝插入的可能就越小。

平端连接要求的条件：

1、低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka，1981）。

2、不存在亚精胺一类的多胺。

3、极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。

4、高浓度的平端。

实验试剂：

凝聚剂： 在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman，1983;Zimmerman和Pheiffer，1983;ZimmermanT Ｈarrison，1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders，1985），可以使如何取得适当浓度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：

1、它们可使平端DNA的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。

2、它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的DNA浓度下，所有的DNA产物也将是线状多聚体。

聚乙二醇（PEG8000）：

1、用去离子水配制PEG8000贮存液（40%）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15%PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和T4噬菌体DNA连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于0℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。

2、连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或MgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman，1983）。

3、浓度为15%的PEG 8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。

4、PEG 8000可刺激短至8个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。

氯化六氨合高钴：

1、氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的5倍（Rusche和Howard-Flanders，1985）。

2、在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状DNA将点尽优势。

3、与PEG8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。

实验步骤：

(以20μl 酶切完后的体系为例）

1、如果要补平或切平，先将样品置于70度水浴10min，将体系放大到50μl，其中按照说明书加入所需klenow buffer和酶，以及BSA等。

2、常温反应10min后将反应物置于37度水浴，再加入T4聚合酶，反应5min。

3、凝胶回收处理的载体或片断。

4、CIAP处理。

5、苯酚氯仿纯化，最后乙醇回收。

6、连接反应。

注意事项：

1、插入片断和载体片断的比例要高。

2、连接酶要加的多点，最好用高浓度的酶。

3、载体片断要做去磷酸化处理。

4、也可以用15%的PEG8000来增加连接效率和减少载体自联。

5、反应体系10μl，不要太大。

6、载体片断不要加多了，一般酶切跑�并割胶纯化并去磷酸化后加0。5微升就可以了。

7、去磷酸化的步骤要根据自己酶的性质而定，一般要反应一个小时，在反应半小时后再补充酶再反应半小时。

8、插入片断和载体片断要酶切良好。