DNA平端连接注意事项

T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。

优点：

1、没有连不上的，只有切不开的。平末端连接不牵扯到粘性末端的碱基突出问题，所以，理论上任何两条DNA序列都能连接在一起，当然需要ligase的酶学作用。这个不同DNA分子之间的连接带来了极大地便利，因为平末端自然是这样，而如果遇到5‘或者3’突出的粘性末端，也可以经过处理成为平末端。

2、有时候，两个平末端连接在一起以后，可以产生另一种内切酶的识别序列，为后续的克隆工作提供了一种机会。

缺点：

1、连接效率比粘性末端低：连接效率之所以比较低，原因之一是在连接过程中只有连接酶的作用，缺乏粘性末端那样突出碱基的互补作用；原因之二是常用的T4DNAligase对于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。

2、可能产生双向插入：由于平端连接的末端没有特异性，连接的时候不能定向，所以两种方向的插入都有可能。这个时候就需要有一种有效的鉴定方法。一般分别在载体和目的片段选择一个酶切位点进行酶切鉴定，当然，具体的鉴定方法要根据具体的实验而定。

3、可能多拷贝插入：平端连接时，可能目的片段多个插入，并且在多个插入的时候还有可能每个插入子以不同方向连接，导致有时候结果难以解释。一般目的片段越大，多拷贝插入的可能就越小。

平端连接要求的条件：

1、 低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。

2、 不存在亚精胺一类的多胺。

3、 极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。

4、 高浓度的平端。

实验试剂：

凝聚剂：在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanTHarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：