腺相关病毒包装流程、注意事项与常见问题

AAV 介绍

腺相关病毒（AAV）属微小病毒科（parvovirus），为无包膜的单链线状 DNA 病毒。只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的 AAV，所以 AAV 被称作腺相关病毒。典型的 AAV2 基因组约 4800bp，包括 2 个反向末端重复序列（ITR，145 bp）和两个读码框（ORF）-Rep 和 Cap（图 1）。ITR 对合成互补 DNA 链是必需的；Rep 和 Cap 可以翻译成多种不同蛋白，如 AAV 生活周期必需的 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40 以及包膜蛋白 VP1、VP2 及 VP3 等。AAV 病毒系统就是用目的基因替换掉 Rep 和 Cap，然后与表达 Rep 和 Cap 基因的质粒共转，从而产生包含目的基因的 AAV。目前 AAV 有 12 种血清型、100 多种变体。不同的血清型对组织或器官有着不同的亲和性。由于安全性高、免疫原性小、表达周期久等优点，AAV 被称为目前最适合在体（in vivo）研究基因功能的利器。

图 1、 AAV2 基因组结构示意图

整体包装流程

图 2、 AAV 包装实验流程图

1. AAV 包装系统：目的基因表达质粒（过表达、干扰等）pHBAAV-xxx、包装载体 pAAV-RC 和 pHelper。
2. 菌株：大肠杆菌菌株 Stbl3。用于扩增 pHBAAV-xxx 及其包装质粒。
3. AAV 病毒的包装细胞株：AAV-293，生长培养基为 DMEM+10% FBS+ 双抗（完全培养基）。

1. 载体构建

AAV 包装之前需要构建表达目的基因的载体 pHBAAV-xxx。可以自由选择启动子、荧光标记、是否需要 Cre 依赖等特点进行定制。质粒构建完成后需要转化后再使用去内毒素质粒试剂盒抽提，要求浓度不低于 1μg/μl，A260/280 在 1.7~1.8。

2. AAV 包装

事先准备好用于包装病毒的 AAV-293 细胞（50-70% 的汇合度，无支原体污染）和病毒质粒，转染一个 10 cm培养皿，成分如下：

表1、AAV 包装过程中转染一个标准 10 cm dish 所需要质粒和转染试剂用量

DMEM 需在 37℃ 水浴中预热，LipoFiter^TM 转染试剂建议恢复至室温后使用，使用前需摇匀。转染后 6h 换新鲜培液。  

3．AAV 收集和纯化

转染后 72h，收集所有的细胞用液氮反复冻融三次收集上清液，然后使用 Benonase 酶消化，所得上清用 Biomiga 品牌纯化柱纯化，所得病毒分装后于 -80°C 保存。AAV 滴度测定采用的国际标准-对 ITR 或者 WPRE 元件采取绝对 qPCR 定量法。

1. AAV 相关实验请在生物安全柜（BL-2 级别）内操作。
2. 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3. 操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用 70% 乙醇加 1% 的 SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用 84 消毒液浸泡后统一处理。
4. 如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5. 动物注射操作请在生物安全柜内（BL-2 级别）完成。
6. 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
7. 实验完毕用洗手液清洗双手。

Q1、腺相关病毒是什么？和实验室⽤的 AAV 载体的区别在哪⾥？

A:腺相关病毒，即 Adeno-Associated Virus (AAV), 是⾃然界中存在的天然病毒，基因组上有 rep 基因和 cap 基因，因此也叫野⽣型腺相关病毒，即 wide type AAV(wtAAV)；实验室⽤的 AAV 载体，是在腺相关病毒的基础上经过⼈⼯改造的质粒，基因组上没有 rep 和 cap 基因，在两个 ITR 之间是外源启动子和需要启动表达的目的序列，rep 和 cap 基因由另外的质粒（rc 质粒）表达，因为 cap 基因决定着向相关病毒的血清型，因此 rc 质粒也被称为血清型质粒，实验室包装的腺相关病毒也被称为重组腺相关病毒，即 recombinant AAV（rAAV）。

Q2、不同的 AAV 血清型主要区别是什么?

几乎所有的 AAV 病毒骨架都是来源 AAV2 型的。AAV 不同血清型的差异在于包裹 AAV 遗传物质的蛋白质外壳（Capsid），比如 AAV5 型、AAV8 型和 AAV9 型等，也可以分别标记为 AAV2/5，AAV2/8 和 AAV2/9，其中 2 代表骨架来源于 AAV2，血清型为 5，8 和 9。

Q3、AAV 病毒载体对目的基因的大小是否有要求？

A：AAV 基因组大小为 4.7kb 左右，由于载体中固有的启动⼦序列、PolyA 序列以及两个 ITR 序列，这三个元件的序列总和在 1200bp 左右，同时可能还带有荧光标记或者抗性标记序列。所以 AAV 载体携带⽬的基因的时候，⽬的基因的长度建议不超过 2kb。目的基因由特异性启动子启动的时，外源插入序列的长度根据启动序列长度而变化，启动子序列较长时可插入的外源序列长度较小，而启动子序列较短时可插入更长的外源序列。

Q4、包毒时转染效率很低，怎么办？

A：AAV 转染的时候，需要保证细胞⽣长状态良好、合适的细胞密度和优化过的感染条件。推荐使用 lipofiter 进行转染，并在包毒前优化转染体系。

Q5、做病毒包装实验时，有时候做出来的病毒滴度很低，甚至不出毒，稳定性很差，为什么？

A：病毒包装涉及多个操作步骤，有⼏个⽅⾯需要注意：

1. 不使⽤来源不清的质粒，使⽤成熟稳定的商业化载体系统；
2. 细胞培养和细胞转染时，需注意细胞密度是否适中和出毒期间细胞的活⼒；
3. 按操作说明进⾏转染，注意排查质粒抽提纯化的异常情况以及⽬的基因的⼤⼩、序列和蛋⽩功能等情况是否对病毒包装产⽣影响。

Q6、用于动物体内实验的 AAV 病毒，是否需要纯化与浓缩？

A：很有必要，AAV 病毒的纯化和浓缩是病毒包装中的必需步骤。细胞裂解液中含有⼤量的病毒⾐壳蛋⽩、宿主细胞碎⽚、⾎清和细胞毒素等多种成分，这些杂质如果直接被注⼊动物体内，会导致宿主强烈的免疫反应。如果病毒滴度太低，达不到感染特定靶器官组织的⽬的。因此 AAV 载体经过纯化和浓缩之后，有利于后续动物体内实验顺利进⾏。