病毒包装与感染实验宝典

慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。

腺病毒介绍 重组腺病毒载体是基于人腺病毒 5 型（Ad5），其基因组是 36kb 长的线性双链 DNA，是一种复制缺陷型腺病毒载体系统。具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率可高达 100%；对外源基因容载能力大（可以高达 8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。最常用的腺病毒包装体系有 AdEas

AAV 介绍腺相关病毒（AAV）属微小病毒科（parvovirus），为无包膜的单链线状 DNA 病毒。只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的 AAV，所以 AAV 被称作腺相关病毒。典型的 AAV2 基因组约 4800bp，包括 2 个反向末端重复序列（ITR，145 bp）和两个读码框（ORF）-Rep 和 Cap（图 1）。ITR 对合成互补 DNA 链是必需的；

慢病毒滴度检测采用稀释计数测定法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。1. 加病毒第二天，准备6个1.5 mL EP管，第一个EP管中加入10 μL病毒原液，然后做3倍梯度稀释，共6个稀释度。2. 追加培养液第三天，有需要加puromycin筛选的孔，先

腺病毒滴度检测采用TCID50法：滴度单位：PFU/mL，是空斑形成单位，为Plaque Forming Unit permL的缩写。1、加病毒将 96 孔板中的 11、12 两列各加入 100 μL 5% FBS 的 DMEM，做阴性对照；96 孔板中的 A-H 排，依次各加 100 μL 标记为 8 个连续梯度稀释的病毒样品溶液，盖上第一个板并在37°C CO 2培养箱中培养；同样步骤操作第二

腺相关病毒滴度检测采用实时荧光定量 PCR 法：滴度单位：vg/mL，指每毫升中含有的病毒基因组拷贝数1、检测步骤稀释标准品质粒，设置标准品的拷贝梯度为 105、106、107、108、109、1010。配置 QPCR 反应体系，每个样品和标准品设计 3 个复孔，进行 QPCR 反应。2、 数据分析（以 HBAAV2/9 -GFP 滴度测度为例）原始实验数据。Roche LC96 实时荧光定量 P

MOI：即 multiplicity of infection，也叫感染复数。很多细胞可以通过文献查阅获取病毒感染的 moi 值。针对无法查询到 MOI 值的细胞可以按照以下步骤进行摸索。

质粒DNA 和其他包装质粒共转染至细胞（293T 细胞）产生病毒，称为病毒包装。

慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，慢病毒具有更广的宿主范围，对于分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

逆转录病毒（Retrovirus） 来源于可感染人和小鼠细胞的 Moloney 鼠白血病病毒（Mo-MLV），和慢病毒一样是一种 RNA 病毒。这类病毒可通过逆转录成为原病毒，然后整合在宿主的基因组中，随着细胞分裂可以稳定的遗传下去。因此。逆转录病毒适合介导外源基因在宿主细胞中长期稳定表达。